Applications industrielles des enzymes lipolytiques et valorisation des lipides de microalgues

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INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Lipases et carboxylestérases : enzymes lipolytiques
1.1. Définition
1.2. Les lipides
1.3. Réactions catalysées
1.4. Exemples de fonctions biologiques
1.5. Histoire moléculaire évolutive
1.6. Caractéristiques structurales
1.7. Mécanisme d’action
1.8. Spécificité de substrat
1.9. Classification des enzymes lipolytiques
1.10. Les enzymes lipolytiques de microalgues
2. Les microalgues marines
2.1. Les microalgues marines dans la Biosphère
2.2. L’histoire évolutive des microalgues
2.3. Position phylogénétique des microalgues
2.4. Microalgues et génomique
2.5. Lipides et acides gras de microalgues
2.6. La microalgue Isochrysis galbana
3. Applications industrielles des enzymes lipolytiques et valorisation des lipides de microalgues
3.1. Applications industrielles des enzymes lipolytiques
3.2. Valorisation commerciale des acides gras et lipides de microalgues
MATERIELS ET METHODES
1. Matériel biologique
1.1. Isochrysis galbana Parke
1.2. Milieu de culture Provasoli
1.3. Culture en Erlenmeyers
1.4. Culture en photobioréacteur
1.5. Suivi de la croissance et récolte de la biomasse
2. Analyse des lipides
2.1. Extraction des lipides totaux
2.2. Analyse par chromatographie sur couche mince
3. Mesure des activités lipolytiques
3.1. Mise en évidence d’une activité lipolytique endogène chez I. galbana
3.2. Mesure de l’activité lipolytique de Saccharomyces cerevisiae transformée avec le plasmide pYES2 recombiné
4. Isolement des acides nucléiques
4.1. Extraction et purification des ARN totaux
4.2. Purification des ARN poly (A+)
4.3. Extraction et purification de l’ADN génomique
4.4. Extraction et purification d’ADN de bactériophages
4.5. Extraction et purification d’ADN plasmidique
5. Analyses des acides nucléiques
5.1. Analyse quantitative
5.2. Analyse qualitative
6. Techniques d’amplification des acides nucléiques
6.1. Transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne
6.2. Amplification rapide des extrémités des ADNc (RACE-PCR)
6.3. Nested-PCR
6.4. Conception des amorces
6.5. Séquençage des produits amplifiés
7. Construction et criblage d’une banque d’ADN complémentaires
7.1. Construction d’une banque phagique d’ADNc
7.2. Criblage de la banque d’ADNc
8. Clonage et expression des séquences codantes
8.1. Le vecteur de clonage et d’expression : le plasmide pYES2
8.2. L’insert (ADNc)
8.3. Digestion enzymatique du plasmide et de l’insert (ADNc)
8.4. Ligation du plasmide et de l’insert
8.5. Préparation de bactéries et de levures électrocompétentes
8.6. Transformation par électroporation.
8.7. Sélection des transformants
8.8. Analyse des clones positifs
8.9. Induction de l’expression du gène cloné et analyse des transcrits
9. Analyses bioinformatiques des séquences
9.1. Bases de séquences
9.2. Analyse des séquences nucléotidiques
9.3. Profils physicochimiques des protéines
9.4. Recherche d’homologies
9.5. Alignements multiples
9.6. Phylogénie
9.7. Prédiction de la structure tertiaire des protéines
RESULTATS ET DISCUSSION
1. Analyse de l’activité lipolytique endogène d’Isochrysis galbana
1.1. Mise en évidence d’une activité lipolytique
1.2. Localisation de l’activité lipolytique
1.3. Conclusion
2. Isolement de 3 gènes codant des enzymes lipolytiques chez Isochrysis galbana
2.1. Construction et criblage d’une banque d’ADN complémentaires
2.2. Exploitation de la banque EST d’Isochrysis galbana (Keeling, 2006)
2.3. Isolement de 3 ADNc codant des enzymes lipolytiques par la méthode de RACEPCR
3. Caractérisation préliminaire et analyses comparatives du gène IgLip codant une lipase hypothétique chez Isochrysis galbana
3.1. Analyse et traduction de la séquence nucléotidique IgLip
3.2. Prédiction des caractéristiques physicochimiques
3.3. Prédiction de la fonction enzymatique
3.4. Prédiction de l’organisation structurale
3.5. Séquences homologues à IgLip chez les microalgues
3.6. Classification d’IgLip et de ses homologues
3.7. Structure intron/exon du gène IgLip
4. Caractérisation préliminaire et analyses comparatives du gène IgEst1 codant une estérase hypothétique chez Isochrysis galbana
4.1. Analyse et traduction de la séquence nucléotidique IgEst1
4.2. Prédiction des caractéristiques physicochimiques
4.3. Prédiction de la fonction enzymatique
4.4. Prédiction de l’organisation structurale
4.5. Séquences homologues à IgEst1 chez les microalgues
4.6. Classification et analyse phylogénétique
5. Caractérisation préliminaire et analyses comparatives du gène IgEst2 codant une estérase hypothétique chez Isochrysis galbana
5.1. Analyse et traduction de la séquence nucléotidique IgEst2
5.2. Prédiction des caractéristiques physicochimiques
5.3. Prédiction de la fonction enzymatique
5.4. Prédiction de l’organisation structurale
5.5. Séquences homologues à IgEst2 chez les microalgues
5.6. Classification
5.7. Structure intron/exon du gène IgEst2
6. Clonage et induction de l’expression des gènes
6.1. Clonage de la séquence codante IgLip
6.2. Clonage et expression de la séquence codante IgEst1
6.3. Clonage et expression de la séquence codante IgEst2
7. Discussion générale
7.1. Confirmation d’une activité lipolytique endogène chez Isochrysis galbana
7.2. Présence de 10 gènes susceptibles de coder des enzymes lipolytiques chez Isochrysis galbana.
7.3. Isolement de 3 gènes codant 1 lipase et 2 estérases hypothétiques chez Isochrysis galbana
7.4. Présence d’isoenzymes chez Isochrysis galbana
7.5. Présence de gènes avec et sans introns chez Isochrysis galbana
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE

PARTIE I Synthèse Bibliographique

1. Lipases et carboxylestérases : enzymes lipolytiques
1.1. Définition
Les lipases et les carboxylestérases sont, au même titre que les phospholipases, des enzymes lipolytiques, c’est-à-dire des estérases qui catalysent l’hydrolyse et la synthèse de lipides. Les lipases et les carboxylestérases sont présentes chez tous les organismes qu’ils soient procaryotes ou eucaryotes. Impliquées dans le métabolisme des lipides, elles jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus vitaux en participant à la libération et la mobilisation des acides gras.
1.2. Les lipides
1.2.1. Les acides gras
Les acides gras entrent dans la composition des lipides. Ce sont des acides carboxyliques (-COOH) à longue chaîne aliphatique (R) hydrocarbonée constituée d’au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras sont amphiphiles, peu solubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques. Leur solubilité dans l’eau est d’autant plus faible que la chaîne est longue et les doubles liaisons nombreuses. On distingue les acides gras saturés, sans double liaison, des acides gras insaturés, avec une (ou plusieurs) double(s) liaison(s), qui procure(nt) de la rigidité à la molécule. Les acides gras insaturés se classent en série selon la place de la première double liaison à partir de l’atome de carbone de l’extrémité méthyle (carbone ω). Par exemple, la première double liaison des acides gras de la série des oméga 3 (ω3) est située à trois atomes de carbone de l’extrémité méthyle.
Sur la Figure 1 sont schématisés quelques acides gras, parmi lesquels figurent l’acide linoléique (C18 :2 ω6) et l’acide α–linolénique (C18 :3 ω3). Ces deux acides gras ne peuvent être synthétisés par l’homme. Ils doivent impérativement être apportés par l’alimentation et sont donc qualifiés d’acides gras indispensables. L’acide palmitique (C16 :0) est un des acides gras saturés les plus répandus. L’acide eicosapentaènoïque (C20 :5 ω3, EPA) et l’acide docosahexaènoïque (C22 :6 ω3, DHA) sont des acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC) de la série des oméga 3.

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Isolement et caractérisation de trois gènes codant une lipase et deux estérases hypothétiques chez la microalgue marine Isochrysis galbana (Prymnesiophyceae, Haptophyta) (8.42 MB) (Rapport PDF)