Réaction de polymérisation (d’amplification)

REACTION DE POLYMERISATION (D’AMPLIFICATION) :

La réaction de polymérisation se déroule dans un petit tube lui-même placé dans un appareil programmable appelé thermocycleur.

Le thermocycleur est programmé comme suit :

- A 94°c

- A 55°c

- A 72°c

Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation ou extension des amorces.

Dénaturation :

A cette température de 94ºC, les liaisons faibles qui assurent la cohésion de la double hélice d’ADN sont rompues pour donner deux simples brins d’ADN.

Hybridation :

55ºCL’hybridation des amorces sur l’ADN repose sur le principe d’appariement des bases complémentaires. Par mouvement, les amorces arrivent à trouver la partie complémentaire à leur séquence au niveau des simples brins. La synthèse du nouveau brin commence à partir de la dernière base de l’amorce sous l’action de l’ADN polymérase.

Elongation :

72ºCLes amorces hybridées à l’ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d’ADN complémentaire de l’ADN matrice. La polymérisation se fait par ajout successif des desoxyribonucleotides présents dans le mélange mixte en large excès. Ces polymérases ne sont pas dénaturées par la chaleur. La plus connue est la Taq DNA polymérase. [24]Les Taq DNA polymérase est une enzyme qui synthétise l’ADN de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’. Elle est extraite des bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme sources hydrothermales du fond des océans.

ELECTROPHORESE SUR GEL d’AGAROSE :

L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules suivant leur charge et leur poids moléculaire sous l’influence d’un courant électrique. Les molécules biologiques possèdent des groupements ionisables et suivant un Ph existant en solution comme des molécules électriquement chargées. Selon la nature de la charge les molécules migreront soit vers la cathode ou l’anode. [1,4] Préparation du gel dans notre cas précis :- Dissoudre 2g d’agarose dans 100ml de TAE Buffer à 1/50- Homogénéiser- Chauffer pendant 3min- Ajouter 3ul/100ml de bromure d’ethidium- Couler le gel dans le matériel en présence des brèches permettant d’obtenir des puits ménages..