Évaluation de la quantité de vitamine A des huiles fortifiée

Prélèvement des échantillons d’huile

Au niveau national, la collecte des échantillons d’huile s’est faite uniquement au niveau des points de vente.Dans l’enquête restreinte de Dakar, les prélèvements ont été effectués à trois niveaux :les usines de production d’huiles de Dakar, les points de vente et les ménages. Dans les usines de production, les échantillons ont été gracieusement obtenus, par contre au niveau des points de vente, l’huile a été achetée, et dans les ménages, des compensations financières ont été données en échange de l’huile trouvée sur place pour ne pas réduire la quantité consommée par le ménage.Les échantillons d’huile sont recueillis dans des flacons en polyéthylène de 60 ml et/ou en verre ambré de 30ml. Ces flacons sont remplis de sorte à ne pas laisser une couche d’air au au- dessus de l’huile, ils sont ensuite étiquetés et protégés de la lumière par du papier aluminium.Les échantillons sont transportés au Laboratoire de Nutrition et conservés à 4°C jusqu’au dosage.

Dosage de la quantité de vitamine A dans les huiles

La mesure de la quantité de vitamine A dans les huiles a été faite par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC). L’HPLC est considérée comme la technique de référence pour la mesure de la concentration en rétinol dans les aliments. C’est une méthode chimique de séparation des constituants d’un mélange en fonction de leur affinité avec d’autres molécules. Nous avons utilisé deux techniques de dosage dans cette étude. D’abord Une micro-méthode pour l’échantillon national et la méthode AFNOR (NF EN 12823-1) pour l’étude restreinte après harmonisation des méthodes de dosages de vitamine A au Sénégal. Le principe de dosage est le même pour ces deux techniques.

Principe

Il consiste à extraire le rétinol contenu dans les huiles fortifiées avec du rétinyl palmitate par saponification à froid au moyen d’une solution d’hydroxyde de potassium éthanolique(KOH), suivie d’une extraction à l’aide de solvants organiques et d’un dosage par HPLC avec détection photométrique (UV à 325 nm). Les substances sont identifiées sur la base de leur temps de rétention, et leur quantité en rétinol déterminée en utilisant la surface de pic du rétinol et l’équation de droite d’une courbe de calibration externe réalisée à partir d’une solution de rétinol purifiée par HPLC.

Appareillage

L’appareillage est une chaîne Spectra SYSTEM comprenant un dégazeur à membrane à quatre voies SCM 1000, une pompe quaternaire à gradient P1000XR, un passeur avec injecteur automatique AS3000, un détecteur à barrettes d’iode UV6000LP et un module d’interface SN 4000, le tout piloté par ordinateur. L’ensemble du système est géré par le logiciel ChromQuest®, version 4.1 (Thermo Electron SAS, Cedex, France) qui traite les résultats. Tous les solvants utilisés pour le dosage sont de grade HPLC.

Modes opératoires

La micro-méthode du laboratoire

Cette technique est développée au laboratoire de nutrition en adaptant la méthode de dosage du rétinol dans le sérum, laquelle a été validée par VITAL-EQA program du CDC.Elle utilise un standard interne et a l’avantage de consommer peu de réactifs. Elle se déroule en 4 phases :

Saponification

Pour chaque échantillon, 0,2 g d’huile sont pesés à l’aide d’une balance à 0,1 mg de précision (OHAUS Corporation, Florham Park, USA) dans un tube en verre de 7ml avec une pipette pasteur. 100 µl de standard interne (SI) (solution purifiée de bêta-apo-8-carotenal), 1 ml d’alcool à 0,1% BHT (hydroxytoluène butylé) et 500 µl de KOH à 60% (60 g pour 100 ml d’eau) sont successivement ajoutés dans le tube contenant l’huile. Le tube bouché est bien mélangé quelques secondes au vortex, emballé avec du papier aluminium et laissé pendant 1 heure à température ambiante. Au bout de cette heure, le processus de saponification est arrêté avec 1 ml d’eau ultra pure (NANOpure® Diamond™, USA).

Extraction

Un (1) ml d’hexane est ajouté dans chaque tube et le mélange est vigoureusement agité au vortex puis centrifugé à 3200 trs/min. La phase hexanique surnageante contenant les extraits de rétinol est récupérée dans un tube en verre de 5 ml. Cette étape est répétée deux fois de suite et les phases hexa niques ainsi récupérées sont mélangées avant d’être évaporées.

Evaporation

L’évaporation est faite sous azote avec l’évaporateur N-EVAP TM112 (Organisation Associates, Berlin, MA 01503, USA). L’extrait sec de vitamine A est repris dans 100 µl de méthanol/dichlorométhane (50/50 V/V) et un volume de 20 µl de cet échantillon est injecté dans l’HPLC.

La méthode AFNOR NF 12823-1

Saponification

Pour chaque échantillon, 2 g d’huile sont pesés à l’aide d’une balance de précision (à 0,1 mg) (OHAUS Corporation, Florham Park, USA) dans un erlenmeyer en verre protégé de la lumière par du papier aluminium. 50 ml d’éthanol à 5% d’acide ascorbique et 5 ml d’une solution de KOH à 60% (60 g pour 100 ml d’eau) sont ajoutés à l’échantillon d’huile dans l’erlenmeyer. Le mélange sous azote est soumis à une légère agitation magnétique pendant 16 heures à température ambiante. Au bout des 16 heures, la saponification est arrêtée avec 50 ml d’eau dans un rapport eau/alcool V/V.

Extraction

La solution saponifiée est transférée dans une ampoule à décanter additionnée de 50 ml d’hexane. Après agitation, le mélange est laissé quelques minutes pour une décantation de la phase organique contenant l’extrait de rétinol qui est récupéré dans un ballon en verre. Cette Opération est répétée 3 fois de suite et les extraits combinés sont rincés 3 fois avec de l’eau ultra pure pour atteindre la neutralité. Les extraits sont ensuite filtrés à travers du sulfate de sodium anhydre pour éliminer les traces d’humidité.

Evaporation

Après extraction, les extraits sont évaporés à l’aide d’un évaporateur rotatif (Rotavapor R 210, BÜCHI, Flawil, Switzerland) sous vide à une température de 45°C. L’extrait sec est repris dans 5 ml de méthanol/dichlorométhane (50/50 V/V) et 20 µl sont injectés dans le chromatographe.

Conditions chromatographiques

Il s’agit d’une chromatographie en phase inverse avec une colonne Resolve TM C18 (3,9x 150 mm) 5 µm, 90 Å, protégée par une pré-colonne (3,9 x 20 mm) (Waters Corporation,Massachusetts, USA). La phase mobile est constituée d’un mélange Méthanol/Eau à 0,01%d’ammonium acétate dans les proportions 89/11 (V/V) avec un débit de 1 ml/min et l’absorbance est fixée à 325 nm. Les solvants utilisés sont de grade HPLC.

Contrôle de qualité

Pour chaque échantillon la mesure est faite en double. Les mesures sont validées après calcul du rendement d’extraction grâce au standard interne (rapport des surfaces de pics d’acétate de rétinol de l’échantillon et du standard interne) pour la micro-méthode. Pour la méthode de dosage selon la norme AFNOR, le contrôle de qualité est effectué avec un échantillon d’huile de Soja dont la concentration moyenne en vitamine A est de 15,8 mg/kg d’huile comprise entre 11,1 et 20,5 mg RE/kg d’huile. Cette huile a été mesurée par un laboratoire de référence 1. Cet échantillon témoin est traité de la même façon que les échantillons essais et au cours du dosage deux à trois points de la solution de rétinol purifiée ayant servi à l’établissement de la courbe de calibration sont mesurés pour vérifier la pente de la courbe de calibration. La nouvelle équation est prise en compte dans le calcul de la concentration en rétinol des échantillons. Les dosages sont repris pour tout échantillon :présentant un rendement inférieur à 95% (micro-méthode),dosé dans les mêmes conditions que l’échantillon témoin dont la concentration en rétinol se situe en dehors de la fourchette définie par le laboratoire de référence,présentant un coefficient de variation supérieur à 7% des mesures en double.

Définition des seuils de fortification

La conformité de l’enrichissement des huiles est vérifiée à 2 niveaux et pour chaque niveau, des seuils ont été définis par l’Association Sénégalaise de Normalisation (ASN 2013).à la production et à l’importation : la teneur en vitamine A doit être comprise entre 16 et 24 mg SE/kg d’huile dans le circuit de distribution : la teneur en vitamine A doit être comprise entre 11 et 24 mg SE/kg d’huile.Par rapport à ces seuils nous avons défini pour les circuits de distribution 4 groupes dont les niveaux d’enrichissement vont de non enrichie à enrichir au-delà des normes.Non enrichies : concentration en vitamine A (VA) < à 1 mg SE/kg d’huile Enrichies en deçà des normes : 1≤ VA <11mg RE/kg d’huile Enrichies aux normes : 11 ≤ VA ≤ 24 mg SE/kg d’huile Enrichies au-delà des normes : VA > 24 mg RE/kg d’huile.