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Préparation de l’extrait

Les racines de la plante codée CCA ont été récoltées dans la région d’Analamanga en novembre 2014. Elles ont été séchées à l’ombre, à la température ambiante et à l’air libre pendant 3mois. Les racines séchées ont été broyées avec un broyeur à marteau en poudre fine. La poudre obtenue a été macérée à froid dans un mélange Ethanol – Eau (60 :40) pendant une semaine à la température ambiante.
Le macérât a été filtré sur du papier wattmann et le filtrat ainsi obtenu a été évaporé à sec sous vide à l’aide d’un rotavapor BÜCHI® à la température de 80°C. L’extrait brut hydro alcoolique obtenu a été codé CCA, puis pesé et le rendement de l’extraction a été calculé à partir de la formule :

Criblage phytochimique

Pour déterminer les différentes familles chimiques présentes dans l’extrait CCA, plusieurs réactifs spécifiques à chaque famille ont été utilisés. La présence de précipité, de coloration ou la formation de mousse après agitation marque la présence d’une des familles chimique présente dans l’extrait (IGAN C., 1982 ; VIJISTELLA B.G. et coll., 2014) (Tableau 1).
Afin de déterminer la teneur de ces familles chimiques dans l’extrait, les signes suivant ont été utilisés :
+++ : Présence en forte teneur
++ : Présence en moyenne teneur
+: Présence en faible teneur
±: présence en très faible teneur

TESTS PHARMACOLOGIQUES

L’activité analgésique centrale et périphérique de l’extrait CCA a été étudiée pour mettre en évidence son activité analgésique.

Les animaux utilisés

Des souris de race SWISS femelles, âgées de 3 mois et pesant entre 20 et 25 grammes ont été utilisées. Elles ont été élevées à l’animalerie du Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie, à la Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo. Ces souris ont été nourries avec de la provende LFL et ont eu libre accès à l’eau. Elles ont été soumises à un cycle de lumière et obscurité de 12h/12h et à la température de 27°C environ.

Étude de l’activité analgésique centrale de l’extrait CCA

L’activité analgésique centrale de l’extrait CCA a été étudiée en appliquant un stimulus thermique au niveau de la queue de la souris (JAYANTHI M.K. et JYOTI M.B., 2012), et en appliquant une pression croissante sur la queue de la souris (ELHABAZI K. et coll., 2014).

Étude de l’activité de l’extrait CCA face à la douleur provoquée par la chaleur

L’activité analgésique centrale de l’extrait CCA a été étudiée en immergeant la queue de la souris dans un bain thermostaté à 50°C.
Neuf souris ont été mises à jeun 14 heures avant le test. Elles ont été réparties en trois lots de trois souris : les animaux du premier lot ont reçu de l’eau distillée à raison de 10ml/kg témoin, et ils ont été pris comme témoins. Les animaux des deux autres lots ont été traités respectivement avec l’extrait CCA aux doses de 400 et 800 mg/kg par voie orale. Ces différents produits ont été administrés par voie orale dans un volume de 10 ml/Kg (ALLCHORNE A.J. et coll., 2005).
Quinze minutes après administration des produits, l’animal a été immobilisé dans une boîte au-dessus du bain thermostaté et 3 cm à partir de la partie distale de sa queue a été immergé dans le bain (Figure 1) (ALLCHORNE A.J. et coll., 2005). Le temps qu’a mis l’animal pour retirer sa queue de l’eau chaude a été chronométré à 15, 30, 45, 60, 90,120 minutes après administration des produits. Pour éviter des dommages tissulaires, le temps maximal d’immersion de la queue des souris a été fixé à 15 secondes (JAYANTHI M.K. et JYOTI M.B., 2012 ; PURMA A.R. et VENKATESHWARA J.R., 2013). L’activité analgésique centrale de l’extrait a été déterminée par le temps de retrait de la queue du bain, chez les souris des lots traitées par rapport à celui des souris du lot témoin.
L’effet analgésique central de l’extrait CCA se traduit par une augmentation du temps de réaction face à la douleur provoquée par la chaleur chez les souris traitées par rapport aux souris du lot témoin. L’inhibition de la sensation de douleur de l’extrait CCA a été déterminée par la formule suivante : Inhibition de la perception de la douleur (%)= (IDID S. Z. et coll., 1998)
T témoin : temps de latence de réaction des animaux du lot témoin (en secondes)
T traité : temps de latence de réaction des animaux du lot traité (en secondes).
15 : 15 secondes imposé comme temps maximal de l’immersion de la queue de l’animal dans l’eau chaude.

Étude de l’activité de l’extrait CCA sur la douleur provoquée par une pression sur la queue

L’activité centrale de l’extrait CCA a été étudiée avec le test de « tail-flik » en appliquant une pression croissante au niveau de la queue de la souris à l’aide d’un algésimètre (Figure 2) (ELHABAZI K. et coll., 2014).
Neuf souris ont été mises à jeun 14 heures avant le test. Elles ont été réparties en trois lots de trois souris : un lot témoin dont les animaux ont reçu de l’eau distillée à raison de 10ml/kg, et deux lots traités avec l’extrait CCA respectivement aux doses de 400 et 800 mg/kg. Ces différents produits ont été administrés par voie orale dans un volume de 10 ml/Kg (ELHABAZI K. et coll., 2014). Quinze minutes après administration des produits, la souris été placée sur l’algésimètre et sa queue a été immobilisée entre la plateforme et la pointe émoussée de l’algésimètre (Figure 3). À partir de cette pression initiale notée 0, une pression croissante a été exercée sur la queue de l’animal jusqu’à ce qu’il réagisse en retirant sa queue. Cette mesure a été effectuée à 15, 30, 45, 60, 90,120 minutes après administration des produits avec un intervalle de 30 secondes sur la partie proximale, médiane et distale de la queue de chaque souris, la moyenne entre ces trois valeurs a été considérée comme pression supportée par la souris. La pression supportée par les souris des lots traités a été comparée à celui du lot témoin (ELHABAZI K. et coll., 2012).
L’activité analgésique centrale de l’extrait a été déterminée par la pression supportée par la queue des souris chez les souris des lots traités par rapport aux souris du lot témoin. La pression exercée sur la patte du rat a été calculée selon les formules suivantes (LE PARC G. et BRIAND P., 2010):
Pression (Pa) = poids (N)/ Surface de l’aiguille (mm2)
Avec Poids (N) = masse (kg) × pesanteur g (N/kg)
Surface de l’aiguille (mm2): 0,785 mm2
Pesanteur g (N/kg) : 9,81 N/Kg
L’effet analgésique central de l’extrait CCA se traduit par une augmentation de la pression supportée par la queue de l’animal chez les souris traitées par rapport aux souris du lot témoin. L’inhibition de la perception de la douleur a été obtenue en utilisant la formule:
Inhibition de la perception de la douleur (%) = (VOGEL G. H. et coll., 2002)
Pt : pression supportée par les animaux du lot témoin
PT : pression supportée par les animaux du lot traité

Etude de l’activité analgésique périphérique de l’extrait CCA par une douleur provoquée par l’injection de formaldéhyde sous aponévrose plantaire.

L’activité périphérique de l’extrait CCA a été étudiée sur la douleur inflammatoire provoquée par l’injection de formaldéhyde à 2,5% sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure de la souris (BARDIN L. et coll., 2009).
Neuf souris ont été mises à jeun 14 heures avant le test. Elles ont été réparties en trois lots de trois souris : un lot témoin dont les animaux ont reçu de l’eau distillée à raison de 10ml/kg, et deux lots traités avec l’extrait CCA aux doses de 400 et 800 mg/kg par voie orale. Ces différents produits ont été administrés par voie orale dont le volume à administrer a été fixé à 10 ml/Kg (MOHAMMAD Z.I. et CHANDRA D.S., 2014).
Trente minutes après administration de ces produits, 50µl de solution de formaldéhyde à 2,5% ont été injectés sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure de la souris (BARDIN L. et coll., 2009). Les souris ont été ensuite placées séparément dans des cages en plexiglas. La réaction de la souris face à la douleur provoquée par l’injection de formaldéhyde est caractérisée par un léchage, une morsure ou un secouement de sa patte endolori (Figure 4). La durée de la réaction de l’animal a été notée pendant les deux intervalles de temps : 0-5 minutes puis de 20-45 minutes après, injection pour le lot traité et le lot témoin. L’activité périphérique de l’extrait a été déterminée par la durée de ces réactions chez les souris des lots traités par rapport à celle du lot témoin dans la deuxième phase (LE BARS D. et coll., 2001 ; OEDRAOGO N. et coll., 2012 ; MOHAMMAD Z.I. et CHANDRA D.S., 2014).
L’effet d’un analgésique se traduit par une diminution de la durée de réaction après injection de formaldéhyde pour les souris ayant reçu l’extrait par rapport aux souris du lot témoin. L’inhibition de la perception de la douleur a été calculée suivant la formule:
Inhibition de la perception de la douleur (%) = (DIARRA M.D., 2006).
T traité : Temps de léchage de la patte enflammée des animaux du lot traité.
T témoin : Temps de léchage de la patte enflammée des animaux du lot témoin.

Rendement de l’extraction

Après extraction de 500g de poudre de la plante avec un mélange éthanol-eau (60 :40), 23g d’extrait CCA ont été obtenus, ce qui donne un rendement de 4,6%. L’extrait CCA à une couleur verdâtre et un aspect poudreux.

Résultats du criblage phytochimique

Le criblage phytochimique effectué sur l’extrait CCA révèle la présence d’alcaloïdes et de sucres réducteurs en forte teneur, des terpénoides et des stéroïdes en moyenne concentration, et une faible teneur en tannins, de polyphenol et de flavonoïdes et de très faible teneur en sucres rares dans l’extrait CCA (tableau II).

PARTIE PHARMACOLOGIQUE

Activité analgésique centrale de l’extrait CCA

Effet de l’extrait CCA sur la douleur provoquée par la chaleur

L’immersion de la queue des souris dans un bain thermostaté à 50°C provoque une douleur à laquelle la souris réagit en retirant sa queue hors de l’eau chaude. Le temps de retrait de la queue est constant pendant le temps d’observation chez les souris du lot témoin. Tandis que le temps de latence de réaction des souris ayant reçu l’extrait CCA à la dose de 400mg/kg et 800mg/kg augmente par rapport à celui des souris du lot témoin.
A partir de la 15ème minutes après l’administration de l’extrait CCA, le temps de retrait de la queue des souris augmente que ce soit chez ceux qui ont reçu la dose de 400mg/kg ou 800mg/kg par rapport au témoin. Cet effet est maximal à la 45 ème minute et régresse à partir de la 60 ème minutes et disparait à la 120ème minute.
À la 30ème minute le temps de latence du retrait de la queue des souris traité avec l’extrait CCA à la dose de 400mg/kg est de 4,33±0,2 secondes soit une inhibition de 22,11% et 24,3% à la dose de 800mg/kg avec 4,63±0,6 secondes de temps de retirement de la queue, contre 1,3±0,2 secondes chez les souris du lot témoin (p<0,05).À la 45ème minute, l’inhibition de la douleur est maximale, elle est égale à 30,95% et 38,41% pour les doses de 400 et 800mg/kg respectivement. Les souris retirent leur queue au bout de 6,30±1,03 secondes et 7,24±0,56 secondes, respectivement à la dose de 400mg/kg et 800mg/kg contre 2,4±1,71 pour les souris du lot témoin (p<0,05). Au-delà de cet effet maximal l’activité de l’extrait CCA diminue jusqu’à la dissipation de son effet à partir de la 60ème minutes avec un temps de réaction égale à 3,88±0,16 secondes pour le lot traité à la dose de 400mg/kg et 3,78±0,1 secondes à la dose de 800mg/kg soit 18,59% et 17,86% d’inhibition de la douleur par rapport au témoin qui réagit au bout de 2,1± 0,7 secondes (figure 5).

Effet de l’extrait CCA sur une douleur provoquée par une pression sur la queue

Face à la douleur induite par la pression appliquée sur leur queue, les souris réagissent en essayant la de retirer. L’extrait CCA augmente le seuil de douleur supportée par la queue des souris qui se traduit par une augmentation de la pression exercée sur la queue des souris ayant reçu l’extrait par rapport aux témoins.
À la 15ème minute, la pression qui fait réagir les souris du lot témoin est égale à 1,15± 0,05 Pa, contre 1,55 ± 0,05 Pa et 1,93 Pa chez les souris traitées respectivement avec la dose de 400mg/kg et 800 mg/kg (p<0,05). Soit à une inhibition de la sensation douloureuse de 35% à la dose de 400mg/kg et 83,75% à la dose de 800mg/kg (p<0,05).
Quarante-cinq minutes après administration de l’extrait CCA, à la dose de 400mg/kg, la pression supportée par la queue des souris est maximale. Elle est égale à 2,25± 0,13 Pa et 2,53 ±0,07 Pa à la dose de 800mg/kg, ce qui correspond respectivement à une inhibition de la sensation de la douleur de 77,88 % et 106,43 % avec la dose de 400mg/kg et 800mg/kg (p<0,05).
Cette inhibition persiste jusqu’à la 90ème minute. A la dose de 400mg/kg la pression supportée par la queue de la souris égale à 1,76 ±0,29 et 2,27± à la dose de 800mg/kg correspondant respectivement pour chaque dose à 41,93% et 82,25% d’inhibition de la sensation de douleur par rapport au témoin (1,24 ± ) (p<0,05).

Effet de l’extrait CCA sur la douleur induite par une injection de formaldéhyde sous aponévrose plantaire chez la souris.

L’injection de formaldéhyde à 2,5% sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure de la souris provoque une inflammation douloureuse entraînant des réactions de léchage, de morsures ou de secouement de la patte endolorie. Ces réactions présentent 2 phases : entre 0-5 minutes et 20-45 minutes. L’extrait CCA diminue le temps de léchage et de morsure de la patte enflammée pendant ces deux phases.
Pour le lot témoin, la durée de léchage de la patte endolorie dans la première phase est de 105,33± 4,93 secondes. A la dose de 400mg/kg, l’extrait CCA diminue ce temps à 70,66±19,50 secondes avec 49,06% d’inhibition de la perception de la douleur, et 53±14,42 secondes à la dose de 800mg/kg, soit une inhibition de 48,03% de la douleur (p<0,05).
Dans la phase tardive, la durée de réaction des souris du lot témoin est de 186,66±39,69 secondes contre 102±14,73 secondes chez les souris traitées avec l’extrait CCA à la dose de 400mg/kg et 55,66±2,11 secondes chez les souris traitées avec l’extrait CCA à la dose de 800mg/kg, soit une inhibition respective de 45,3 et 70,18% (p<0,05) pendant la deuxième phase (figure 7).
D’après nos résultats, l’administration de l’extrait CCA par voie orale, augmente le temps de retrait de la queue immergée dans l’eau chaude et le seuil de sensibilité de la queue de la souris face à une pression croissante. Ces résultats signifient que l’extrait possède une activité analgésique centrale (JAYANTHI M.K. et JYOTI M.B., 2012 ; K. et coll., 2014).
Le retirement de la queue ou le cri de la souris suite à l’immersion de sa queue dans l’eau chaude ou l’application d’une pression sur sa queue est un réflexe spinal. Ces stimuli agissent sur les nocicepteurs associées aux fibres nerveuses (ELHABAZI K. et coll., 2012) et génèrent un influx douloureux sous forme de potentiel d’action acheminé vers le système nerveux central pour y être perçu ce qui entraine les réflexes sus mentionnés (LE BARS D. et coll., 2001; PERAGUT J.C. et ROUSSEL P., 2006). L’augmentation du temps de latence de retirement de la queue et l’augmentation de la pression supportée par la queue de la souris signifient que le réflexe de l’animal est retardé autrement dit la perception de la sensation douleur est inhibée et que l’extrait CCA possède une activité analgésique centrale en occupant éventuellement les récepteurs opioïdes (JAYANTHI M.K. et JYOTI M.B., 2012 ; HAJJ A., 2012). Le stimulus thermique active les récepteurs opioïdes mu (µ) tandis que la pression stimule les récepteurs opioïdes kappa (ĸ) (HAYES A. G. et coll., 1987).
Des études effectuées sur Mallotus Repandus par HASAN M. et ces collaborateurs (2014) ont montré que son activité analgésique centrale serait due aux alcaloïdes qu’elle contient. Ces familles chimiques agiraient au niveau des récepteurs opioïdes. D’autre part, ABID M. et ses collaborateurs (2013) ont travaillé sur l’extrait d’Artemisia Annua et TAHERIAN A. A. et ses collaborateurs (2009) sur l’extrait de Thymus vulgaris ont montré que les flavonoïdes sont responsables de l’activité analgésique de ces plantes en se fixant sur les récepteurs opioïdes. Ces molécules se fixent sur les récepteurs opioïdes mu et kappa et bloqueraient la transmission de l’influx douloureux vers le système nerveux central responsable de la perception de la douleur ce qui explique l’inhibition de la sensation douloureuse (HAYES A. G. et coll., 1987 ; ABID M.et coll., 2013). La présence d’alcaloïdes et de flavonoïdes dans l’extrait CCA suggère que son activité analgésique centrale pourrait être due à ces familles chimiques.
L’injection de formaldéhyde sous l’aponévrose plantaire de la souris provoque un réflexe de léchage ou de morsure de la patte enflammée (ADEYEMI O.O. et coll., 2011).
L’administration par voie orale de l’extrait CCA diminue le temps de léchage de la patte enflammée, ce qui signifie que la perception de la douleur chez la souris a diminué. Le formaldéhyde injecté sous l’aponévrose plantaire des souris provoque une réaction inflammatoire en deux phases : une phase précoce correspondant à la stimulation directe des fibres nociceptives C suite à la libération de la bradykinine et de la substance P et une phase tardive correspondant à la libération de la prostaglandine, de l’histamine et de la sérotonine qui diminuent le seuil d’activation des nocicepteurs induisant la douleur inflammatoire (OUEDRAOGO N. et coll., 2012 ; TAHERIAN A. A. et coll., 2009 ; ADEYEMI O.O. et coll., 2011). Les analgésiques périphériques inhibent la phase tardive (OUEDRAOGO N. et coll., 2012), et les analgésiques centraux inhibent ces deux phases nociceptives (OUEDRAOGO N. et coll., 2012 ; VINOTH P. V. et coll., 2011). D’après nos résultats, l’extrait CCA diminue le temps de léchage et de morsures de la patte enflammée dans les deux phases, c’est-à-dire qu’il possède une activité analgésique périphérique et centrale.
L’activité analgésique périphérique de l’extrait serait due à l’inhibition de la stimulation des nocicepteurs par ces substances algogènes et provoquerait l’augmentation de leur seuil d’activation. Ce test montre que l’extrait CCA agirait au niveau des nocicepteurs et confirment également son activité analgésique centrale mise en évidence avec les tests utilisant les stimuli thermique et pression sur la queue de la souris.
TAHERIAN A. A. et ses collaborateurs (2012) ont également utilisé du formaldéhyde pour étudier l’effet analgésique de l’extrait hydroalcoolique de Coriandrum Sativum, et ils ont trouvé que l’extrait agit sur les deux phases. Ils en ont conclu que cet extrait possède une activité analgésique centrale en agissant sur la modulation de la perception de la douleur en stimulant le système opioïde et une activité analgésique périphérique en inhibant la production de prostaglandines. Selon eux, la présence de flavonoïdes dans l’extrait serait responsable de cet effet (OUEDRAOGO N. et coll., 2012 ; TAHERIAN A. A. et coll., 2012 ; VINOTH P. V. et coll., 2011).Selon ADEYEMI O. O. et coll. (2011), les alcaloïdes présents dans l’extrait de Hunteria umbellata inhibent la perception de la douleur, en agissant au niveau périphérique et central (ADEYEMI O. O. et coll., 2011 ; SRIVASTAVA A. et coll., 2011). Des études in vitro effectuées avec l’extrait Solanum surattense par VIJAY A.L. et coll. (2015) et Solanum melongena par SRIVASTAVA A. et coll. (2011) ont montré que les stéroïdes et les saponines dans ces extraits sont responsables de leur activité analgésique périphérique. Le criblage phytochimique effectué sur l’extrait CCA révèle la présence de ces différentes familles chimiques (flavonoïdes, stéroïdes, saponines). L’activité analgésique de l’extrait CCA pourrait être due à l’inhibition de la synthèse de prostaglandines.
Des études approfondies sur des molécules isolées présentes dans l’extrait CCA responsable de son activité analgésique apporteraient des précisions sur son mécanisme d’action.

Table des matières

INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
A- PARTIE CHIMIQUE
1. Préparation de l’extrait
2. Criblage phytochimique
B-TESTS PHARMACOLOGIQUES
1. Les animaux utilisés
2.Étude de l’activité analgésique centrale de l’extrait CCA
2.1 Étude de l’activité de l’extrait CCA face à la douleur provoquée par la chaleur
2.2 Étude de l’activité de l’extrait CCA sur la douleur provoquée par une pression sur la queue
3. Etude de l’activité analgésique périphérique de l’extrait CCA
RESULTATS
A-PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l’extraction
2. Résultats du criblage phytochimique
B- PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Activité analgésique centrale de l’extrait CCA
1.1 Effet de l’extrait CCA sur la douleur provoquée par la chaleur
1.2 Effet de l’extrait CCA sur une douleur provoquée par une pression sur la queue
2. Activité analgésique périphérique de l’extrait CCA
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIES

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