Activité antibactérienne des écorces de Carapa procera (Méliacées)

 Mise en évidence des alcaloïdes

Principe : Ce sont des réactions de précipitation : en solution aqueuse acide, les sels d’alcaloïdes donnent, avec les composés iodés des métaux lourds, des précipités colorés caractéristiques. Ainsi on obtient avec : – le réactif de Bouchardât un précipité brun – le réactif de Dragendorff un précipité rouge-orangé – le réactif de Valser-Mayer un précipité blanc-jaunâtre 

Chromatographie sur couche mince (CCM)

• Support : plaque de silice • Solvant : Chloroforme –Diéthylamine (45-5 v/v) • Dépôts : Solution d’extrait Solution d’hyocyamine Solution d’atropine Solution de scopolamine • Révélation : ƒ Examen sous UV. ƒ Mettre la plaque à l’étuve à 100°C durant 10 mn afin d’éliminer totalement la diéthylamine ; ƒ Pulvériser sur la plaque le réactif à l’iodoplatinate de potassium. Observer les couleurs différentes selon les alcaloïdes. On peut également révéler par le réactif de Dragendroff convenablement dilué, mais tous les alcaloïdes se révèlent en rouge orangé.

Extraction

Une macération méthanolique a été effectuée sur 100 g de poudre d’écorce de Carapa procera avec 750 ml de méthanol sous agitation pendant 48 heures à la température ambiante. Après filtration sur papier filtre, le résidu solide est remis dans le méthanol récupéré pour une deuxième macération de 48 heures qui sera à son tour filtrée sur papier filtre. Ce dernier est enfin repris par 3×200 ml de méthanol. Les différentes portions réunies avec la première sont concentrées sous vide au Rotavapor puis séché à l’air libre. 

Fractionnement

10 g d’extrait sec ont été repris dans 100 ml de méthanol à laquelle on ajoute 30 ml d’eau distillée, le tout transvasé dans une ampoule à décanter. Pour fractionner nous avons d’abord mélangé avec la solution méthanolique 3×100 ml d’hexane. Il apparaît à chaque fois deux phases (phase hexanique et méthanolique) qui se distingue par leur couleur et qui sont séparées. La phase méthanolique est en rouge foncé et la phase hexanique en jaune. Les différentes phases hexaniques sont réunies, concentrées sous vide et séchées à l’air ambiante. On obetient alors un extrait huileuse hexanique. Ensuite nous avons mélangé la phase méthanolique avec 3×100 ml de dichlorométhane et la technique utilisée est la même que précédemment. Mais ici la phase dichlorométhanique se distingue par une coloration rouge moins intense. On obtient alors une phase dichlorométhanique et une phase méthanolique qui seront concentrées sous vide puis séchées à l’air ambiante. 

Essais biologique

Préparation des fractions

Chaque fraction a été reprise avec du méthanol, à raison de 200 mg par 1 ml de méthanol.

Test d’activité antibactérienne

Principe

Les bactéries sont ensemencées sur gélose de Mueller-Hinton et sur gélose au sang cuit pour Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae. Les extraits aqueux sont déposés dans des cupules disposées sur le milieu gélosé. Après un séjour du milieu ensemencé pendant 24 heures à l’étuve à 37°C, on juge l’activité de l’extrait alcoolique par la grandeur du diamètre de la zone d’inhibition de la culture autour de chaque cupule.

Mode opératoire

A partir d’une culture de 18 heures à 24 heures, on prépare des inoculums équivalents à l’étalon de Mac-Farland 0,5 (106 bactéries/ml). Sur chaque plaque de gélose coulée en boite de pétri, on dépose une goutte de la dilution de culture (inoculum) et on l’étale par stries serrés avec un écouvillon stérile, sur toute la gélose de Mueller-Hinton ainsi que sur la gélose au sang cuit. On répartit ensuite régulièrement sur la gélose, des cupules. Dans chaque cupule on introduit 100 microlitres d’extrait de plante qui va diffuser de façon homogène. Durant toute la durée de l’incubation (24 heures à 37°C), la souche à étudier entre en compétition avec l’effet inhibiteur de l’extrait de plante. Il se forme une zone d’inhibition circulaire autour de la cupule lorsque la souche est sensible aux extraits et une absence de zone d’inhibition si la souche est résistante

Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI)

Principe : Selon l’O.M.S, la CMI est la plus faible concentration d’antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d’une bactérie donnée, appréciable à l’œil nu, après une période d’incubation donnée. I

Mode opératoire

Après avoir réalisé nos gammes de dilution (voir tableau IX), 1ml de chaque dilution sera incorporer dans 19 ml de milieu gélosé puis coulé dans une boîte de pétri. L’ensemble de ces boîtes sera ensemencé grâce à un inoculateur à têtes multiples qui permet d’ensemencer en même temps plusieurs souches dans la même boîte. Après une incubation de 24 heures, la CMI sur chaque souche est déterminée par l’inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d’antibiotique.