Application de l’approche non ciblée pour l’analyse des composés émergents ou inconnus

L’approche non-ciblée est principalement employée en métabolomique et a été adaptée pour l’analyse de petites molécules dans divers domaines (pharmaceutique, sécurité alimentaire, analyse environnementale, médicale, etc.). Il s’agit d’une approche multidisciplinaire mettant en jeu des outils d’analyse chimique et chimiométriques ; plus précisément, la préparation des échantillons, la séparation chromatographique et le traitement des données (Figure 17). Elles reposent principalement sur l’utilisation des analyseurs à temps de vol (TOF) ou des analyseurs Orbitrap qui ont gagné en popularité en raison de leur grande capacité à fournir des données de qualité exceptionnelles et des informations plus complètes concernant la masse moléculaire exacte, la composition élémentaire et la structure moléculaire détaillée d’un composé donné.  Les données sont acquises en mode full scan ce qui permet la recherche de plusieurs centaines de molécules à la fois, connues et inconnues, dans différentes matrices complexes (animales, végétales, biologiques). L’acquisition d’une empreinte chimique globale de l’échantillon offre la possibilité de réaliser des fouilles de données successives et illimitées en nombre et dans le temps (analyse rétrospective) permettant ainsi l’identification de nouveaux contaminants préoccupant. L’association des analyseurs HRMS avec les quadripôles permet  d’enregistrer des spectres de fragmentation (MS2) indispensables pour l’élucidation structurale des composés détectés. Il convient de noter que les méthodes d’analyse LC- HRMS génèrent une quantité importante de données qui doivent être minutieusement traitées afin d’extraire l’information pertinente. L’identification précise de molécules inconnues est longue et complexe, elle requière de multiples étapes de filtration et de traitement de données  impliquant l’utilisation de différents outils chimiométriques (tests statistiques univariés et multivariés).

Les stratégies pour les analyses LC-HRMS sont très différentes selon les groupes de recherche. Pour identifier des composés inconnus, chaque laboratoire dispose de ses propres « workflow », plusieurs études ont été présentées dans la littérature notamment dans le domaine de l’analyse environnementale (Agüera et al., 2013; Ferrer and Thurman, 2003; Krauss et al., 2010; Schymanski et al., 2015) mais aussi en sécurité alimentaire (Castro- Puyana et al., 2017; Le Boucher et al., 2015; Tengstrand et al., 2013). Malgré la spécificité des protocoles décrits, un schéma global a pu être tiré de ces diverses études englobant le screening ciblé, le screening suspect et le screening non ciblé. Cette stratégie générique décrite par Krauss et al. (2010) (Figure 18) peut-être optimisée et adaptée en fonction des instruments utilisés et la finalité de l’étude. Le screening ciblé fait référence au screening basé sur l’utilisation d’étalons de référence mesurés en interne, ce qui permet de confirmer par comparaison du temps de rétention, la concordance de masse exacte, la correspondance du modèle isotopique et enfin la concordance spectrale MS/MS. Les analyses ciblées ont pour objectif final la quantification des composés d’intérêt. Cette approche est la plus communément utilisée dans le cadre d’analyses de routine.

Le screening suspect ne désigne pas nécessairement des composés nouveaux mais peut être utilisé pour des composés qui n’étaient pas initialement recherchés lors de l’analyse. Il peut s’agir de composés connus comme pouvant potentiellement être présents dans les échantillons (analogues, produits de dégradation et/ou de métabolisation par exemple). Contrairement à l’analyse ciblée quantitative, le criblage de composés « suspects » n’est pas tributaire de l’utilisation de standards pour l’identification et la confirmation. Dans le domaine des biotoxines marines, une minorité de standards est disponible à l’heure actuelle. Cependant, des informations spécifiques à chaque molécule existent, telles que la formule moléculaire et la formule développée. Ces informations peuvent être utilisées lors des processus de confirmation de l’identité des « suspects ». La formule moléculaire permet dans un premier temps de calculer le rapport m/z exact de l’ion moléculaire recherché. Ce dernier est par la suite extrait du spectre haute résolution sous forme de chromatogramme. En ionisation electrospray, les ions majoritairement formés (à quelques exceptions près pour certaines molécules formant des adduits) sont le [M+H]+ ou le [M-H]-, ce qui facilite les tentatives d’identification (Krauss et al., 2010). Les fragments ou ions isotopiques caractéristiques sont par la suite évalués en comparant les spectres expérimentaux MS ou MS/MS, ou le fragment majoritaire avec ceux reportés dans la littérature (Chemspider, PubChem, MassBank, Metlin etc…) (Diaz et al., 2012) ou en se rapportant à la théorie. Idéalement, la disponibilité du standard permettra apostériori une identification formelle (grâce aux profils isotopiques, temps de rétention et spectres de fragmentation). Cette approche de criblage des suspects peut aussi se faire grâce aux bases de données « maison » (constituées par chaque laboratoire sur leur(s) matériel(s) et logiciel(s) disponibles) contenant