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Réponses immunitaires dirigées contre le parasite Leishmania
La piqûre d’un phlébotome infecté par le parasite, s’accompagne de l’activation rapide du système immunitaire inné non spécifique. Ce dernier fait intervenir les protéines du complément ainsi que certaines populations cellulaires comme les neutrophiles, les macrophages et les cellules NK «Natural Killer». Une infiltration des neutrophiles et un recrutement des macrophages sont généralement observés quelques heures après l’infection. Les promastigotes sont alors phagocytés par ces cellules. Les parasites sont aussi capturés par les CD qui migrent vers les ganglions lymphatiques pour assurer la présentation antigénique aux LT naïfs, permettant de les stimuler. Ces derniers se différencient en LT effecteurs producteurs de cytokines. La différenciation des LT spécifiques des antigènes (Ags) de Leishmania en sous populations cellulaires distinctes (Th1, Th2, Th17 et T régulateurs) est décisive dans la détermination et l’orientation de la réponse immune adaptative anti-Leishmania. Elle est principalement gouvernée par un ensemble de paramètres immunologiques (environnement cytokinique et interaction entre les différentes cellules) et parasitologiques (virulence du parasite) et assure la mise en place de la protection contre l’infection ou, au contraire, est associée à l’aggravation de la maladie (Alexander et Brombacher, 2012; Scott et Novais, 2016; Rossi et Fasel, 2018).
La figure 6 représente les interactions initiales entre le parasite et le système immunitaire inné ainsi que l’initiation de la réponse immunitaire adaptative. Toutefois, cette chronologie reste hypothétique.
Interactions initiales entre le parasite et les cellules phagocytaires: La réponse immune innée
La réponse immunitaire innée, non spécifique constitue la première ligne de défense face à l’infection par Leishmania. Cette réponse fait intervenir les cellules phagocytaires (neutrophiles, macrophages, CD et monocytes), les cellules lymphocytaires NK et les molécules du complément. Le contrôle du parasite durant les premières phases de l’infection dépend de l’action coordonnée de ces divers acteurs du système immunitaire innée de l’hôte.
La piqûre par le phlébotome infecté s’accompagne assez rapidement de l’activation du système du complément. Le fragment C3b du complément facilite la formation du complexe d’attaque membranaire CAM (C5b-C9) et sa fixation à la surface du parasite afin de le lyser (Figure 6-1). La fixation du CAM peut être inhibée par des molécules de virulences du parasite comme le lipophoshoglycane (LPG) et la protéase GP63 (Gurung et Kanneganti, 2015).
Parmi les phénomènes d’échappement du parasite durant ces premières étapes, son opsonisation par les fragments C3b et C3bi (C3b inactivé), qui va faciliter sa capture par les cellules phagocytaires comme les neutrophiles et les macrophages, à travers la fixation sur le récepteur CR3 (récepteur du complément 3). L’opsonisation du parasite par des anticorps facilite aussi sa pénétration dans les cellules phagocytaires comme les CD, via le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines (FcγR) (Woelbing ., 2006).
Quelques heures après l’inoculation du parasite, les neutrophiles sont les premières cellules à atteindre le site d’infection (Chang, 1981; Laskay ET AL., 2008; Peters ET AL., 2008). Ces cellules ont la capacité de phagocyter les promastigotes mais les parasites sont incapables de se différencier en amastigote à l’intérieur des neutrophiles (Mollinedo ET AL., 2010) (Figure 6-2).
Une fois phagocytés, les parasites entrainent l’apoptose des neutrophiles qui libèrent des chimiokines comme le MIP-1β, permettant le recrutement des macrophages au niveau du site inflammatoire (van Zandbergen ET AL., 2004). Les macrophages phagocytent les fragments apoptotiques des neutrophiles contenant aussi le parasite, et ce dernier peut pénétrer de façon silencieuse à l’intérieur des macrophages et continuer sa multiplication (Laskay ET AL., 2003). Les neutrophiles sont donc utilisés par le parasite comme cheval de Troie pour pénétrer à l’intérieur des macrophages (Gueirard ET AL., 2008). Il a aussi été démontré que le statut apoptotique ou nécrotique des neutrophiles phagocytés par les macrophages infectés pouvait influencer le devenir intracellulaire du parasite dans le macrophage (Afonso ET AL., 2008). Les neutrophiles peuvent libérer des pièges extracellulaires composés par des filaments d’ADN qui favorisent l’immobilisation et la mort des parasites extracellulaires (Guimaraes-Costa ET AL., 2009).
Les cellules ‘tueuses naturelles’ ou NK sont aussi recrutées au niveau des sites de l’infection, probablement, juste après les neutrophiles (Thalhofer ET AL., 2011). Les NK sont la première source d’IFN-γ précoce qui favorise la différenciation des cellules T CD4+ en cellules de type Th1 impliquées dans la protection contre le parasite (Diefenbach ET AL., 1998). Une infiltration abondante des cellules NK a été décrite au niveau des sites de cicatrisation alors que le nombre de ces cellules diminue au cours d’une infection progressive, suggérant un rôle protecteur des cellules NK au cours de la leishmaniose humaine (Pereira Les macrophages sont importants dans l’établissement de l’infection et dans la persistance du parasite à l’intérieur de l’hôte. C’est la seule cellule qui va permettre la différentiation du promastigote métacyclique en amastigote et sa multiplication intracellulaire.
Cette cellule est aussi la seule cellule capable d’éliminer le parasite lorsqu’elle est activée: Une fois à l’intérieur des macrophages, les promastigotes se différencient en amastigotes au sein des vacuoles parasitophores. Ces vacuoles se caractérisent par un pH acide et contiennent des quantités importantes de protéines lysosomales ainsi que des protéines impliquées dans les processus de dégradation et d’apprêtement des Ags. Les leishmanies sont capables de résister à l’environnement hostile des vacuoles parasitophores (Podinovskaia et Descoteaux, 2015). Le parasite utilise des stratégies pour assurer sa survie à l’intérieur du macrophage parmi lesquelles sa capacité à bloquer partiellement la production de dérivés actifs d’oxygène et du monoxyde d’azote (NO) qui sont fatales pour le parasite. Ce dernier, peut également inhiber la sécrétion de l’IL-12 macrophagique, cytokine déterminante pour la protection (Reiner et Locksley, 1995; Carrera et al., 1996; Podinovskaia et Descoteaux, 2015) et à induire la production de molécules immunorégulatrices telles que l’IL-10 et le Transforming growth factor beta (TGF-β), connues pour leur capacité à inhiber les fonctions macrophagiques (Kane et Mosser, 2001).
Les CD constituent aussi une population cellulaire majeure intervenant lors des premières phases de l’infection. Ces cellules sont les principales cellules présentatrices (CPA) d’Ags leishmaniens aux cellules T naïves et donc les principales cellules initiatrices de la réponse immune adaptative anti-Leishmania (von Stebut et al., 1998) (Figure 6-3). Les CDs sont capables de phagocyter les leishmanies via les récepteurs CR1 et CR3, la lectine de type C DC-SIGN et les récepteurs aux IgG, FcɣRI et FcɣRIII. Ces cellules sont aussi capables de produire différentes cytokines telles que l’IL-12, l’IL-10 et l’IFN-γ (Soong, 2008). Au début de l’infection par Leishmania, les CD représentent la source majeure d’IL-12, cytokine favorisant la différenciation des cellules T naïves en lymphocytes de type Th1 impliquées dans la protection (von Stebut et al., 1998; Martinez-Lopez et al., 2015) (Figure 6-3).
L’inoculation du parasite au niveau du derme s’accompagne de l’activation du complément. 1-La molécule C3b du complément est inactivée par la molécule GP63. Le C3b inactivé (iC3b) se lie aux antigènes GP63 ou LPG facilitant le processus de phagocytose du parasite par les macrophages. 2-Les neutrophiles sont rapidement recrutés au niveau du site de l’infection. Ces cellules sont capables de phagocyter les parasites parmi lesquels certains peuvent survivre jusqu’à ce que les neutrophiles subissent l’apoptose. Les fragments apoptotiques des neutrophiles infectés vont être phagocytés par les macrophages, ce qui induit la sécrétion de molécules anti-inflammatoires par ces cellules favorisant ainsi la réplication intracellulaire du parasite. 3- Une fois à l’intérieur des macrophages, le parasite utilise une variété de mécanismes de virulence pour supprimer la réponse leishmanicide de la cellule hôte. Les macrophages infectés peuvent faciliter la survie et la réplication intracellulaire du parasite, ou peuvent être exposés à des signaux activateurs comme l’IFN-γ, produit principalement par les cellules Th1 ou les NK. L’IFN-γ régule positivement l’iNOS, une enzyme produisant l’oxyde nitrique (NO), molécule toxique pour le parasite. Les CD peuvent également phagocyter le parasite et migrer vers les ganglions lymphatiques pour présenter les antigènes du parasite aux cellules T CD4 + naïves et initier la réponse adaptative. IFN-γ: Interféron gamma; IL-12: interleukine-12; iNOS: oxyde nitrique synthase inductible; TH0: T CD4+Naïve; CR1: Récepteur du complément 1; CR3: Récepteur du-complément 3; FcR : Récepteur pour le Fc des Immunoglobulines ; Fn: Fibronectine; CAM: Complexe d’attaque membranaire
La réponse immune adaptative au cours des leishmanioses
Réponse T CD4+
Réponse T CD4+ au cours de la leishmaniose expérimentale murine
Le modèle expérimental murin a apporté les premiers arguments en faveur de l’implication et l’importance des sous populations T CD4+ Th1 et Th2 dans l’évolution de l’infection par Leishmania (Scott et al., 1988; Heinzel et al., 1989; Sacks et Noben-Trauth, 2002). C’est aussi par l’étude des souris infectées par des leishmanies qu’une partie des mécanismes gouvernant la différenciation des LT CD4+ naïfs en cellules de type Th1 productrices d’IFN-γ ou en cellules Th2 productrices d’IL-4, IL-5 et IL-13, a été élucidée.
Les souris C57BL/6 sont résistantes à l’infection expérimentale par L. major et développent une maladie qui régresse spontanément et qui confère une immunité durable et spécifique à la réinfection. En revanche, les souris BALB/c sont sensibles à l’infection par Leishmania et développent une maladie qui évolue vers la viscéralisation du parasite aboutissant à la mort de l’animal. La résistance chez la souris C57BL/6 a été corrélée au développement d’une réponse cellulaire de type Th1 associée à la production de cytokines impliquées dans la protection comme l’IL-12 et l’IFN-γ. L’IFN-γ est responsable de l’activation des fonctions leishmanicides du macrophage. Cette activation est principalement due à l’induction par l’IFN-γ de l’expression de la NO synthase (iNOS), une enzyme qui catalyse la synthèse d’un composé toxique pour les amastigotes, le monoxyde d’azote (NO) (Bogdan et al., 2000; Kima et Soong, 2013). L’IL-12 est aussi une cytokine clé dans la génération d’une réponse protectrice Th1 contre l’infection et est nécessaire au maintien des cellules Th1 durant l’infection (Pakpour et al., 2008). Il a aussi été démontré que le TNF-α agissait en synergie avec l’IFN-γ pour activer les macrophages à éliminer les parasites (Wilhelm et al., 2001; Ritter et al., 2004) (Figure 7).
L’exploration de la réponse immune chez les souris BALB/c sensibles à l’infection par L. major a révélé une réponse de type Th2 médiée par la production d’IL-4. Il a été démontré que les souris BALB/c déficientes en IL-4 et infectées par L. major demeurent susceptibles à l’infection (Noben-Trauth et al., 1999) alors que d’autres travaux ont démontré que ces mêmes souris BALB/c devenaient résistantes (Kopf et al., 1996; Mohrs et al., 1999).
Un rôle dans la susceptibilité à l’infection expérimentale chez les souris BALB/c, a été aussi attribué à l’IL-13. Des souris BALB/c IL4Rα-/-, déficientes pour la chaine α du récepteur de l’IL-4 (IL4Rα), laquelle est aussi un composant du récepteur de l’IL-13, deviennent plus résistantes à l’infection que les souris BALB/c IL4-/- déficientes en IL-4 (NobenTrauth et al., 1999). Les cytokines immunosuppressives telles que l’IL-10 ont aussi été impliquées dans la susceptibilité des BALB/c à l’infection par L. major. Des BALB/c IL-10-/- sont plus résistantes à l’infection par L. major que des souris sauvages (Kane et Mosser, 2001). L’IL-10 est capable d’inhiber les réponses Th1 mais aussi d’activer la production de l’arginase et des polyamines par les macrophages infectés, favorisant ainsi la prolifération intracellulaire des parasites (Liu et Uzonna, 2012).
Bien que ce paradigme Th1/Th2 reste toujours valable dans le modèle murin, plusieurs études ont démontré aussi l’importance d’autres populations T CD4+ comme les cellules T rég et les lymphocytes Th17 qui pourraient influencer le devenir de la maladie (Alexander et Brombacher, 2012; Scorza et al., 2017). Il a été démontré que les T rég CD4+CD25+ jouaient un rôle crucial dans la persistance du parasite, par la production d’IL-10 au niveau des sites de l’infection chez les souris C57BL/6 (Belkaid et al., 2002a; Mendez et al., 2004). La contribution des cellules Th17, dans l’évolution des leishmanioses murines, a été rapportée (Lopez Kostka et al., 2009). Cette population sécrète de l’IL-17, cytokine pro-inflammatoire qui a été associée à la progression de l’infection expérimentale de souris sensibles BALB/c, en favorisant le recrutement des neutrophiles (Lopez Kostka et al., 2009). Cependant, une autre étude a montré l’implication des cellules Th17 dans l’induction d’une immunité protectrice, chez des souris C57BL/6 vaccinées avec le parasite L. major vivant couplé au CpG DNA (Wu et al., 2010).
Il est intéressant de noter que la différenciation des T CD4+ naïfs en sous populations Th1, Th2, T rég ou Th17 dépendrait de plusieurs facteurs tels que l’espèce parasitaire en cause (virulence), le fond génétique de l’hôte et la balance entre les cytokines secrétées au cours de la réponse innée (Gollob et al., 2014) (Figure 7).
Ces cytokines impliquées dans la différenciation vont agir en modulant les activités microbicides des macrophages infectés. Un environnement cytokinique riche en IL-12 et en IFN-γ est essentiel au développement d’une réponse Th1 productrice d’IFN-γ et de TNF-α (Alexander et Brombacher, 2012). La prédominance de l’IL-4 et de l’IL-10 dans le milieu cytokinique, favoriserait la différenciation de T CD4+ en Th2 et en T rég, respectivement. Ces deux populations cellulaires possèdent des activités associées à la pathologie et à la régulation (Heinzel et al., 1989; Scott et al., 1989; Xu et al., 2003).
La prédominance des cytokines IL-13, IL-6 et IL-1, orienterait la différenciation des LT CD4+ vers un phénotype Th17 avec sécrétion de l’IL-17 (Alexander et Brombacher, 2012).
Une réponse immunitaire efficace contre le parasite Leishmania dépend du développement des sous populations T CD4+ de type Th1 capables d’activer les réponses leishmaniacides des macrophages et monocytes hôtes.
La différenciation des T CD4+ en sous populations distinctes (Th1, Th2, T rég et Th17) dépend du microenvironnement des cytokines sécrétées lors de l’activation initiale des cellules T CD4+ naïves. En fonction de plusieurs facteurs (cytokines impliquées dans la différenciation, molécules de co-stimulation et génétique de l’hôte), une cellule T CD4+ peut se différencier en une sous-population bien déterminée qui va produire des cytokines effectrices agissant sur le devenir de l’infection (Résistance/ susceptibilité/ régulation).
Réponse T CD4+ au cours de la leishmaniose humaine
Chez l’homme la dichotomie Th1/Th2 n’est pas aussi clairement associée à la résistance versus susceptibilité comme c’est le cas chez la souris.
La guérison de la leishmaniose humaine est généralement associée au développement d’une immunité de longue durée contre la réinfection. Le contrôle et la résolution de l’infection sont associés au développement de LT spécifiques des Ags leishmaniens et producteurs d’IFN-γ et de TNF-α. L’IFN-γ favorise le contrôle parasitaire en activant les macrophages infectés à produire des molécules leishmanicides telles que le monoxyde d’azote (NO) capables de tuer les parasites intracellulaires (Kemp et al., 1993; Kima et Soong, 2013).
La réponse immune cellulaire peut être étudiée, in vivo, par un test cutané à la leishmanine ou Leishmanin Skin Test (LST), ou, in vitro, après stimulation des PBMC de patients par des préparations antigéniques soluble de Leishmania. Le LST est évalué par la mesure du diamètre de l’induration induite par l’injection intradermique de leishmanine et permet de mesurer la réaction d’hypersensibilité retardée induite par les cellules Th1 CD4+ (Sokal, 1975). Il est en général, positif chez les individus guéris, mais aussi chez des individus asymptomatiques (Ben Salah et al., 2005). Le LST constitue un indicateur utile au cours des études épidémiologiques et des études évaluant des candidats vaccins, puisqu’il permet d’estimer l’exposition au parasite et la prévalence de l’infection (Ben Salah et al., 2005; Bettaieb et al., 2014).
Selon l’espèce parasitaire en cause (espèces dermotropes ou viscérotropes de l’ancien ou du nouveau monde), la forme clinique et le statut immunitaire du patient, le profil de la réponse T CD4+ varie et différentes sous populations cellulaires peuvent aussi être impliquées.
– Réponse T CD4+ au cours de la LC due aux espèces de Leishmania de l’ancien monde (L. major)
Des réponses de type Th1 (prolifération et production d’IFN-γ) sont généralement observées, chez des individus guéris et chez des individus LST+ n’ayant aucun antécédent de LC, après stimulation, in vitro, des PBMC par des Ags leishmaniens (Kemp et al., 1994; Gaafar et al., 1995; Sassi et al., 1999; Ajdary et al., 2000). Une concordance de 98% a été observée entre la réponse au LST et la prolifération, in vitro, aux Ags solubles de Leishmania, chez des individus LST+ (Sassi et al., 1999).
Des analyses par cytométrie de flux ont montré que la source cellulaire majeure de la réponse proliférative et de la production d’IFN-γ était des cellules T CD4+ (Ajdary et al., 2000). Des cellules T CD4+ mémoires effectrices productrices d’IFN-γ, ainsi que des T CD4+ mémoires centrales productrices d’IL-2, ont été décrites en réponse à une stimulation par du SLA, chez des individus immuns à la LC (Keshavarz Valian et al., 2013).
Plus récemment, il a été démontré que le processus de guérison d’une LC due à L. major s’accompagnait d’une baisse du pourcentage des cellules T CD4+ et des cellules T CD4+ polyfonctionnelles (productrices d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-2) spécifiques des Ags leishmaniens (Lakhal-Naouar et al., 2015). Une immuno-modulation, impliquant des mécanismes dépendants des cellules T CD8+, durant le processus de guérison, a été suggérée (Lakhal-Naouar et al., 2015). Au cours des formes sévères de LC, les réponses prolifératives aux Ags leishmaniens sont faibles et des taux d’IL-10 importants ont été détectés (Ajdary et al., 2000). Cependant, une évolution défavorable de lésions cutanées dues à L. major a été associée à la présence de taux élevés de cytokines Th2 (IL-10) mais des cytokines Th1 (IFN-γ) ont aussi été détectées (Louzir et al., 1998). Les auteurs ont suggéré que la sévérité de ces lésions cutanées n’était pas due à une réponse Th1 inefficace mais plutôt à l’inhibition de cette réponse par l’expression simultanée de cytokines Th2 (IL-10) (Louzir et al., 1998).
Récemment, une étude immuno-histochimique comparative entre 2 formes cutanées sévissant en Tunisie, LCZ due à L. major et LCS due à L. infantum, a montré une prédominance de cellules T CD4+ dans les 2 types de lésions, des taux d’ARNm de l’IFN-γ plus élevés dans les lésions LCS et des taux d’ARNm de l’IL-8 plus élevés dans les lésions LCZ (Boussoffara et al., 2019).
D’autres cytokines, comme l’IL-13 et l’IL-17, ont aussi été évaluées au cours de l’infection cutanée humaine par les espèces de l’ancien monde.
L’IL-13, une cytokine Th2, a été associée à un profil Th2 et a été impliquée dans la susceptibilité à l’infection cutanée par L. guyanensis (Bourreau et al., 2001). Des taux similaires d’IL-13, ont été démontrés chez des individus guéris de LC due à L. major et chez des individus sains, en réponse à une stimulation par du SLA (Nateghi Rostami et al., 2010b). Cependant, plus récemment, des taux significatifs d’IL-13, détectés en réponse à une stimulation par des parasites L. major vivants, ont été décrits chez des individus LST+ vivant en zone d’endémie de LCZ due à L. major, mais pas chez des individus naifs (Kammoun-Rebai et al., 2016).
L’IL-17 est une cytokine pro-inflammatoire, essentiellement produite par les cellules T CD4+, dont le rôle au cours de la leishmaniose humaine demeure mal élucidé. Cette cytokine a été impliquée dans la progression de l’infection murine par L. major (Gonzalez-Lombana et al., 2013) mais, de façon paradoxale, dans le contrôle de l’infection par L. infantum chez la souris (Nascimento et al., 2015). Récemment, elle a été décrite en réponse à une stimulation par le parasite L. major vivant, chez des individus immuns à la LCZ due à L. major mais aussi chez des individus naïfs (Kammoun-Rebai et al., 2016).
Concernant l’implication des T rég naturelles (exprimant les marqueurs CD25 et Foxp3), une augmentation de la fréquence de ces cellules a été détectée au cours de l’infection chronique par L. major (Hoseini et al., 2012).
La réponse cytotoxique a été aussi explorée durant l’infection humaine par L. major. Il a été démontré que les cellules T CD4+ y compris les T reg, était capables de produire du GrB, après une stimulation, in vitro, des PBMC d’individus guéris d’une LCZ, par une préparation d’Ags sécrétés/excrétés (Naouar et al., 2014).
– Réponse T CD4+ au cours de la LC due aux espèces de Leishmania du nouveau monde
La LC américaine (LCA) inclut (i) la LC localisée (LCL) due à L. braziliensis, L. mexicana, L. guyanensis ou L. amazonensis, (ii) la leishmaniose cutanéo-muqueuse (LCM) due à L. braziliensis et (iii) la leishmaniose cutanée diffuse (LCD) due à L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis ou L. guyanensis. La LCM et la LCD sont les formes les plus graves. Les infections par L. braziliensis peuvent conduire à des affections cutanées pouvant évoluer en des formes cutanéo-muqueuse.
La phase active de LCL due à L. braziliensis a été associée à un profil mixte Th1/Th2 avec production de taux élevés d’IFN-γ, de TNF-α, d’IL-12, d’IL-4 et d’IL-10, alors que la guérison a été associée à une réponse Th1 avec une production importante d’IFN-γ (Castellano et al., 2009).
Une production excessive de TNF-α a été positivement corrélée à la taille des lésions cutanées due à L. braziliensis (Oliveira et al., 2011).
Dans les régions où la L. braziliensis est endémique, environ 1 à 10% des patients atteints d’une LCL progressent vers une LCM (Torres-Guerrero et al., 2017). En phase active de LCM, les lésions contiennent des cellules T activées ainsi que d’autres cellules inflammatoires, avec une charge parasitaire faible (Ridley et al., 1989). Une comparaison des profils de cytokines entre patients LCM et patients LCL, a montré des taux plus élevés d’INF-γ et de TNF-α avec des taux plus faibles d’IL-10 et de TGF-β ainsi qu’une fréquence plus élevée de cellules T CD4+ et T CD8+ activées, chez les patients LCM (Bacellar et al., 2002). Des taux d’IL-17 plus élevés chez des patients LCM par rapport à des patients LCL, ont permis de suggérer l’implication de cette cytokine dans la progression de la maladie (Bacellar et al. , 2009, Boaventura et al., 2010, Souza et al., 2012). L’IFN-γ, le TNF-α et l’IL-17 ont aussi été rapportés durant la phase active de la LCM (Souza et al., 2012).
L’absence de corrélation entre la fréquence de monocytes producteurs de TNF-α et de monocytes producteurs d’IL-10, décrite chez des patients atteints de LCM, alors que l’inverse est observé chez des patients atteints de LCL, souligne l’importance des cytokines régulatrices dans la modulation de la réponse Th1 (Gaze et al., 2006). La production des taux anormalement élevés de cytokines pro-inflammatoires avec une incapacité à réguler négativement cette réponse, pourrait être à l’origine des destructions tissulaires observées au cours de la LCM (Gaze et al., 2006; Carvalho et al., 2007).
Dans le cas de la LCD, de faibles taux de cytokines de type Th1 sont observés chez les patients (Peacock et al., 2007; Oliveira et al., 2011). Cependant, au niveau du site lésionnel, la réponse immunitaire des patients atteints de LCD est similaire à celle observée au cours des LCL (Machado et al., 2011). La diminution de la réponse immunitaire de type Th1 dans le sang périphérique des patients atteints de LCD pourrait être due à l’attraction des cellules T activées vers les lésions cutanées multiples (Machado et al., 2011).
L’absence d’ulcération et la croissance incontrôlée des amastigotes chez les patients souffrant d’une LCD sont la conséquence d’une réponse immunitaire cellulaire anergique avec un nombre significativement réduit de cellules productrices d’IFN-γ, d’iNOS et d’IL-12 (Diaz et al., 2006).
– Réponse T CD4+ au cours de la LV
La majorité des individus infectés par des souches viscérotropes de Leishmania ne développe pas la maladie et demeure asymptomatique, seule une minorité d’entre eux va développer les signes cliniques d’une LV.
Une réponse T CD4+ avec sécrétion de taux élevés d’IFN-γ et d’IL-5 a été associée à l’infection asymptomatique à L. infantum (Mary et al., 1999). Des taux élevés d’IFN-γ et d’IL-17 ont aussi été observés au cours de l’infection asymptomatique à L. donovani (Pitta et al., 2009).
Au cours de la phase active de la LV, une hypergammaglobulinémie est généralement observée, avec la présence d’anticorps anti-Leishmania, lesquels sont inefficaces pour neutraliser le parasite, mais utiles pour le diagnostic (Ryan et al., 2002).
Cette phase active est aussi caractérisée par une IDR négative en réponse au LST, des réponses cellulaires T aux Ags leishmaniens, réduites ou absentes (Bacellar et al., 1996; Singh et Sundar, 2014), et des taux élevés d’IFN-γ, de TNF-α, d’IL-10 et d’IL-6 dans le plasma (Hailu et al., 2005, Caldas et al., 2005, Ansari et al., 2006, Costa et al., 2012). Cependant, plus récemment, des taux élevés d’IFN-γ ont été détectés dans le sang total (QuantiFERON) de patients en phase active de LV, de façon similaire à des individus guéris de LV ou ayant une infection asymptomatique (Singh et al., 2012). La détection d’IL-10 en même temps que l’IFN-γ chez les patients en phase active a permis de les distinguer des autres groupes d’individus (Singh et al. 2012).
Des taux sériques élevés d’IL-10 et de TGF-β chez des patients atteints de LV, ont été associés à la gravité de cette infection (Holaday et al., 1993; Kurkjian et al., 2006; Saha et al., 2007). Le TNF-α a aussi été associé à la progression de la maladie (Gama et al., 2004).
Globalement, il semblerait que, durant la phase active de la LV, la réponse immune cellulaire T soit dominée par la présence de taux élevés de cytokines jouant un rôle down-modulateur, comme l’IL-10 et le TGF-β, toutes deux empêchant la mise en place d’une réponse Th1 efficace et protectrice.
– Réponse T CD4+ polyfonctionnelle
Plusieurs études ont démontré que la seule évaluation de la production d’IFN-γ en tant qu’indicateur de protection n’était pas suffisante, puisque cette cytokine était aussi observée durant des phases actives et évolutives de la maladie.
Des études ont montré que l’efficacité de la protection conférée par les cellules effectrices ou mémoires était directement liée à leur capacité à sécréter plusieurs cytokines en même temps, en réponse à une activation (Darrah et al., 2007; Lindenstrom et al., 2009; Lin et al., 2015). Il a été rapporté que des cellules T CD4+ ne sécrétant que l’IFN-γ avaient une faible capacité à se développer en cellules T mémoire en comparaison avec les cellules productrices à la fois d’IL-2 et d’IFN-γ (Wu et al., 2002; Foulds et al., 2008). Le rôle des cellules T polyfonctionnelles a été démontré au cours des leishmanioses (Darrah et al., 2007, Macedo et al., 2012). Il a été rapporté que des cellules T CD4+ mémoire centrales produisant de façon simultanée l’IFN-γ, le TNF-α et l’IL-2, constituaient un bon indicateur de protection chez des souris vaccinées par un Ag leishmanien MML et un ligand de TLR-9 (CpG) (Darrah et al., 2007). Les cellules T CD4+ multifonctionnelles ont aussi été détectées chez des individus guéris de LCL (Macedo et al., 2011).
Réponse T CD8+
Les cellules T CD8+ ont été impliquées, avec les T CD4+, dans le contrôle de l’infection expérimentale murine ainsi que dans l’établissement d’une réponse mémoire efficace, à travers leur capacité à produire de l’IFN-γ (Okwor et al., 2014).
Chez la souris, le rôle protecteur des LT CD8+ a initialement été décrit lors de la réinfection (Muller, 1992; Huber et al., 1998). Cependant, lorsque des modèles de souris infectées avec de faibles doses de parasites ont été utilisés, mimant l’infection naturelle, un rôle crucial a été rapporté pour les LT CD8+, dans le contrôle de l’infection primaire (Belkaid et al., 2002b; Uzonna et al., 2004; Okwor et al., 2014).
La localisation du parasite dans les vacuoles parasitophores du macrophage a rendu difficile la compréhension des voies d’activation des T CD8+, à savoir la présentation des Ags de Leishmania aux cellules T CD8+ par les molécules du CMH de classe I (CMH-I). Des travaux ont permis de suggérer que les Ags de Leishmania reconnus par les T CD8+ spécifiques seraient principalement des Ags de surface ou secrétés (Kima et al., 1997; Bertholet et al., 2005). Cependant, une autre étude évaluant le potentiel vaccinal de protéines histones de Leishmania chez la souris, a rapporté la présence de cellules T CD8+ spécifiques des histones, lesquelles sont des protéines intracellulaires (Iborra et al., 2004).
Le mécanisme par lequel des Ags exogènes sont présentés par les molécules CMH-I aux cellules T CD8+, s’appelle présentation croisée de l’Ag (cross-présentation) et les CPA impliquées dans ce mécanisme sont, généralement, les CD ou les macrophages (Lopez et al., 1993; Rodriguez et al., 1999; Guermonprez et al., 2003; Houde et al., 2003; Bertholet et al., 2006).
La présentation des Ags exogènes de Leishmania aux cellules T CD8+ spécifiques pourrait se faire à travers les phagosomes, de façon indépendante des transporteurs TAP (Transporter associated with Antigen Processing) (Houde et al., 2003; Bertholet et al., 2006), ou après fragmentation dans le cytosol par le protéasome et présentation via la voie classique (Kima ET AL., 1997).
Au cours de l’infection cutanée humaine par Leishmania, les cellules T CD8+ ont été impliquées à la fois dans la protection et dans la pathogenèse.
La réponse immune protectrice observée chez des individus ayant guéris d’une LCZ due à L. major est médiée non seulement par des cellules T CD4+ Th1, mais aussi par des cellules T CD8+, toutes deux productrices d’IFN-γ (Nateghi Rostami ET AL., 2010a).
Une augmentation du pourcentage des cellules T CD8+ a été associée à la guérison des lésions d’une LCL, ML ou LCD, chez des individus infectés par L. major, L. braziliensis ou L. mexicana (Salaiza-Suazo ET AL., 1999; Da-Cruz ET AL., 2002; Da-Cruz ET AL., 2005).
Un nombre élevé de cellules T CD8+ a été détecté dans les lésions de LCL, forme la moins grave de l’infection par L. mexicana, en comparaison avec de faibles taux dans les lésions de LCD, forme la plus grave de la maladie, suggérant que la réponse T CD8+ est associée au contrôle de l’infection chez les patients LCL alors que la chronicité de l’infection observée chez les patients LCD, serait associée à un appauvrissement en T CD8+ (Hernandez-Ruiz ET AL., 2010). L’implication des cellules T CD8+ dans la pathogénicité a surtout été rapportée dans les lésions cutanées sévères dues à L. braziliensis.
Le recrutement de cellules T CD8+ productrices de granzyme A, indicateur de cytotoxicité, a été associé à la progression des lésions chez des patients ayant une LC due à L. braziliensis (Faria et al., 2009).
Table des matières
Introduction
Prérequis et état de l’art
I. Biologie et épidémiologie des leishmanioses
I.1. Agent pathogène: Le parasite Leishmania
I.2. Vecteur: Le phlébotome
I.3. Hôtes et réservoirs
I.4. Cycle parasitaire
I.5. Symptomatologie
I.5.1. Leishmaniose viscérale
I.5.2. Leishmanioses tégumentaires
I.5.3. Leishmaniose cutanéo-muqueuse (LCM)
I.6. Répartition géographique des leishmanioses
I.6.1. Répartition géographique des leishmanioses dans le monde
I.6.2. Répartition géographique des leishmanioses en Tunisie
I.7. Diagnostic des leishmanioses
I.8. Traitement des leishmanioses
II. Réponses immunitaires dirigées contre le parasite Leishmania
II.1. Interactions initiales entre le parasite et les cellules phagocytaires: La réponse immune innée
II.2. La réponse immune adaptative au cours des leishmanioses
II.2.1. Réponse T CD4+
II.2.2. Réponse T CD8+
II.2.3. Lymphocytes B et réponse humorale
II.3. Mécanisme de développement de la résistance et de la mémoire immunitaire contre les leishmanioses
II.3.1. Réponse mémoire développée dans le modèle murin
II.3.2. Réponse mémoire développée chez l’homme
III. Vaccination contre les leishmanioses
III.1. Leishmanisation
III.2. Vaccins de première génération
III.2.1. Vaccins à base de parasites vivants atténués
III.2.2. Vaccins à base de parasites inactivés ou d’extraits parasitaires totaux
III.3. Vaccins de seconde génération
III.4. Vaccins à base d’ADN
III.5. Vaccins peptidiques
III.5.1. Principe de la vaccinologie inverse et la vaccination peptidique
III.5.2. Validation de l’immunogénicité des peptides multi-épitopiques conçus par bioinformatique
III.5.3. Avantages et inconvénients des vaccins peptidiques
III.5.4. Adjuvants utilisés dans les vaccins peptidiques
III.5.5. Sélection des Ags candidats comme source des épitopes
III.5.6. Vaccins peptidiques épitopiques contre les leishmanioses
III.5.7. Concepts immunologiques fondamentaux pour la compréhension de la vaccination peptidique
Matériel et méthodes
I. Matériel
I.1. Groupes de donneurs
I.1.1. Donneurs immuns (guéris de LCZ) utilisés pour évaluer l’immunogénicité des peptides
I.1.2. Donneurs naïfs utilisés pour évaluer l’immunogénicité des peptides
I.2. Antigènes et peptides multi-épitopiques
II. Méthodes
II.1. Processus de conception, in silico, des peptides multi-épitopiques
II.2. Evaluation de l’immunogénicité des peptides multi-épitopique chez des individus guéris d’une leishmaniose cutanée due à L. major
II.2.1. Stimulation des PBMC par les pools de peptides et induction de la sécrétion des cytokines
II.2.2. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
II.2.3. CBA (Cytometric Beads Array)
II.2.4. ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent SPOT assay)
II.2.5. Typage HLA des individus CLm
II.2.6. Cytométrie en flux
II.2.7. Analyse statistique
II.3. Evaluation de l’immunogénicité des peptides multi-épitopiques chez des individus sains
II.3.1. Coculture des LT CD8+ naïfs avec les CD pulsées avec les peptides multiépitopiques
II.3.2. ELISPOT
II.3.3. Typage HLA
II.3.4. Marquage immunofluorescent des molécules membranaires des cellules et analyse par cytométrie en flux
Résultats
I. Constitution des pools de peptides multi-épitopiques utilisés dans les tests de stimulation cellulaire
II. Evaluation de l’immunogénicité des peptides multi-épitopiques chez des individus guéris d’une LCZ due à L. major
II.1. Analyse de la réponse cytokinique (IFN-γ et IL-10) induite par les peptides multiépitopiques, chez les individus guéris d’une LCZ, par ELISA
II.1.1. Analyse de la réponse IFN-γ
II.1.2. Analyse de la réponse IL-10
II.2. Enumération par ELISPOT des LT spécifiques des pools de peptides
II.3. Dosage des taux de TNF-α et de GrB induits par les pools de peptides
II.4. Caractérisation phénotypique des populations lymphocytaires T spécifiques des peptides multi-épitopiques
II.4.1. Caractérisation des populations lymphocytaires T CD4+ et T CD8+ productrices de cytokines
II.4.2. Caractérisation de la réponse T mémoire centrale (TCM) et T mémoire effectrice (TEM)
III. Evaluation de la fréquence des cellules T spécifiques des peptides multi-épitopiques, préexistantes dans le répertoire T des individus sains non infectés par Leishmania (N-Fr).
III.1. Evaluation des marqueurs de surface sur des CD générées à partir des monocytes.
III.2. Evaluation des marqueurs de surface des cellules T CD8+ naïves purifiées
III.3. Analyse des marqueurs membranaires des cellules T CD8+, après coculture avec les CD matures pulsées avec le P21R (Cytométrie en flux)
III.4. Analyse de la fréquence des cellules T CD8+ productrices d’IFN-γ, après coculture avec les CD matures pulsées avec le P21R (ELISPOT).
Discussion
Conclusion et perspectives
Références
Annexe
