Cours caractérisation de la nature et du profil des VE, tutoriel & guide de travaux pratiques en pdf.

Biomarqueur pour la progression de la maladie

Nous avons de surcroit évalué le potentiel des VEE comme biomarqueur des différents états de la MP. Pour ce faire, nous avons analysé les corrélations du ratio VEE par érythrocytes par rapport à certaines échelles cliniques de la maladie telles que le UPDRS, le H&Y, le MMSE, le BDI et le ACE. Nos résultats révèlent que le coefficient de corrélation linéaire entre l’échelle du UPDRS et le nombre de VEE se rapproche de 1. Les régressions linéaires montrent que 87 % de la variation du ratio VEE/érythrocyte est expliqué par la fluctuation du UPDRS. Les intervalles de confiance montrent un seuil d’erreur de moins de 5 %. Nos résultats révèlent également deux corrélations distinctes séparant les patients de divers stades.
Nous avons observé que les patients ayant un résultat inférieur à 37 au UPDRS sont caractérisés par une augmentation du nombre de VEE au stade précoce de la maladie. Il existe de façon similaire, une corrélation entre les scores de 37 et 75 qui définit les patients à un stade plus avancé de la MP. Comme le UPDRS comprend plusieurs sections, nous avons regardé si le lien entre cette échelle et la concentration de VEE est spécifique à une section (aspects non moteurs, aspects moteurs, langage, etc.). Nos résultats montrent qu’aucune catégorie spécifique du UPDRS ne semble associée aux fortes corrélations observées. Malgré notre analyse exhaustive, la scission est toujours difficile à expliquer puisque le UPDRS ne possède pas de stratification des résultats clairement détaillés comme le H&Y. La mise à jour du UPDRS par la Société des troubles du mouvement (MDS-UPDRS) à amener la communauté des cliniciens à réfléchir sur une méthode pour estimer la gravité de la maladie. Martínez-Martín et collaborateur ont montré qu’un résultat de MDS-UPDRS entre 30 et 35 semble marquer un seuil de distinction entre les patients précoces et les patients modérés (Martínez-Martín et al., 2015). Ce seuil est attribué principalement à l’évaluation motrice qui constitue la plus grande partie de l’échelle clinique. Bien que notre analyse ait été réalisée avec le UPDRS standard, nous pensons que la scission peut permettre de différencier deux stades de la maladie. La diminution précipitée de la concentration de VEE au début du stade modéré pourrait être une cause d’un changement systémique chez le patient. L’étude exhaustive des érythrocytes dans la MP pourrait potentiellement permettre d’expliquer ce phénomène.

Validation des résultats

Nous avons également reproduit la quantification totale des vésicules sur une cohorte indépendante de patients souffrant de la maladie d’Huntington. Les résultats ne révèlent aucune différence entre les prémanifestes, les manifestes et les contrôles sains pour tous sous-types de vésicules incluant les VEE. Nous pouvons ainsi présumer que le nombre de VEE corrèle spécifiquement avec le UPDRS et donc la MP.
Afin de valider nos résultats, nous avons étudié si des facteurs externes à la maladie pouvaient influencer la quantification de VEE. En premier lieu, nous avons étudié la prise de médicaments pour chaque participant. Nous n’avons tenu compte d’aucune médication non parkinsonienne puisque les traitements entre les participants sont extrêmement variés. Chez les parkinsoniens, nous avons regardé le lien entre la dose équivalente journalière de lévodopa et le nombre de VEE. Les données montrent que l’augmentation de VEE n’est pas une conséquence du changement de médications liée à la lévodopa. De plus, nous avons observé une augmentation significative de la concentration de VEE dans le plasma des participants atteints de diabète et de cancer, patients et contrôles confondus. Il a été rapporté que le diabète réduit la déformabilité érythrocytaire et augmente l’agrégation de ces derniers (Cho et al., 2008). De plus, il semble que les VE dérivés du sang soient impliqués de diverses manières dans ces deux maladies (Tokarz et al., 2015; Żmigrodzka et al., 2016). Nous avons donc décidé d’exclure ces participants de nos analyses. Finalement, les plasmas comportant un niveau d’hémoglobine libre élevée (> 45 000 ng/ml), potentiellement due à l’hémolyse lors de la collecte de sang, ont également été exclus des analyses liées aux VEE.

Contenu protéique des VEE

Le deuxième objectif de notre étude était de caractériser le contenu protéique des VEE.

Méthodes d’activation

Pour l’étude des VEE, il est nécessaire de les isoler et les concentrer. Nous avons essayé, dans un premier temps, d’isoler les vésicules directement du plasma. Malheureusement, les techniques utilisées, optimisées davantage pour les cellules, n’ont pas fonctionné avec d’aussi petites et peu nombreuses particules. Nous avons donc tenté d’activer les érythrocytes d’une facon la plus physiologique possible. Selon plusieurs études, les ions calcium semblent être la clé de la biogénèse de vésicules extra cellaires. Ils participent à l’activation ou l’inhibition de protéines et phospholipides au niveau de la membrane cellulaire. Le calcium ionophore A23187 provoque un changement dans la concentration de calcium induisant la vésiculation. Contrairement à l’eau et la congélation, souvent utilisé pour provoquer la libération de VEE, ce composé évite de faire éclater ou de détruire la membrane des érythrocytes (Nguyen et al., 2016). Cependant, bien que le taux d’ion calcium change en condition physiologique, notamment avec l’âge, le A23187 induit un changement d’ion supérieur à ce qui est réellement observé fixant ainsi une limite à notre méthode in vitro.
Nous avons imagé, par microscopie électronique à balayage, des érythrocytes au repos et activés de patients et contrôles afin de comparer la morphologie des cellules. Bien que ces images montrent la vésiculation des érythrocytes, aucune différence entre les individus n’a pu être observée.

Quantification d’α-Syn par ELISA et microscopie

Bien que l’α-Syn soit très présente dans les tissus cérébraux, des études montrent qu’on la retrouve également en quantité importante dans le sang et plus particulièrement dans les érythrocytes laissant présager sa présence dans les VEE (Barbour et al., 2008). Nous avons donc regardé la concentration d’α-Syn totale et d’une forme phosphorylée (Sérine 129) dans les VEE en microscopie électronique entre des patients à un stade modéré de la maladie et leurs contrôles. Suite aux résultats ne montrant aucune différence entre les groupes pour les deux types d’α-Syn, nous avons effectué une quantification de la protéine totale par ELISA chez des patients aux stades précoce et modéré ainsi que chez les contrôles. Contrairement à la méthode par microscopie électronique, l’ELISA est beaucoup plus quantitatif et nous permet d’obtenir des valeurs en nanogramme par millilitre. Les résultats confirment que la concentration d’α-Syn reste similaire entre les patients et les personnes saines. On peut donc conclure que le niveau d’expression de cette protéine dans les VEE ne peut servir de biomarqueur. Cependant, l’α-Syn pourrait tout de même jouer un rôle majeur au sein des érythrocytes.

Protéomique

À la vue des résultats précédents, nous avons décidé d’analyser le protéome entier des VEE de patients aux stades précoce et modéré ainsi que leurs contrôles afin de détecter une éventuelle signature protéique entre les participants. Étant donné la grande quantité d’hémoglobine qui subsiste dans les VEE, nous avons effectué deux types d’approches distinctes afin d’optimiser la détection de l’ensemble du protéome des VEE. Nous avons réalisé une première approche où l’ensemble du protéome fût analysé en un bloc, révélant ainsi un total de 356 protéines. Nous avons, par la suite, utilisé une deuxième approche qui consiste à séparer l’hémoglobine des autres protéines et de les analyser séparément. Par cette méthode nous avons détecté 818 protéines. De plus, une analyse par Gene Ontology, comparant nos échantillons avec l’ensemble du génome humain, montre un enrichissement, des protéines associées aux vésicules et aux complexes d’hémoglobine.
Parmi les 818 protéines, il nous a été possible d’identifier 8 protéines significativement modulées entre les groupes. Une heat map nous a d’ailleurs permis de mettre en évidence 3 groupes de protéines. Le premier groupe constitué les protéines (gènes) AIDA, ABHD14B et NADSYN1 qui sont moins exprimées chez l’ensemble des patients. Les protéines (gènes) QDPR, AKR1A1 et CNRIP1 constituent le deuxième groupe où l’expression semble être plus importante chez les patients au stade précoce. Finalement, le troisième groupe constitué de USP24 et ATP5A1 est significativement plus exprimé chez les patients au stade modéré.
La documentation concernant l’implication de ces protéines dans la MP est rare. Toutefois, les ARN messagers pour la protéine CNR semblent diminués dans le striatum chez un modèle animal de MP (Zeng et al., 1999). On remarque également que des variantes génétiques de USP24 semblent responsables d’un risque associé à la MP (Li et al., 2006). De plus, on retrouve plusieurs formes d’ATP synthase à des concentrations anormales chez les parkinsoniens pouvant expliquer le changement d’expression de l’ATP5A1 (Ferrer et al., 2007).