Chimie Analytique
Quantification de cannabinoïdes
Le cannabis, nom latin donné au chanvre, est cultivé principalement au Pakistan, en Afghanistan, au Maroc, en Amérique Latine …et sur nos balcons. Son principe actif majoritaire, à effet psychotrope, est le D9 tétra hydrocannabinol (C21H30O2, noté THC), dont la teneur, suivant les variétés, peut varier de 0,5 à 22%. Ses cibles sont deux récepteurs cellulaires, CB1 et CB2, situées dans le cerveau. De manière aiguë, il induit une tachycardie. Le rythme cardiaque redevient normal au bout de 24h, alors que l’aptitude intellectuelle reste affectée. Après inhalation de fumée de cannabis, 18% du THC est absorbé et passe rapidement dans le flux sanguin. Les concentrations plasmatiques sont alors de l’ordre de 8 à 10 µg/l pour une consommation isolée et de 50 à 200 µg/l pour un consommateur régulier. Il est rapidement métabolisé par le cytochrome P450 2C9 en 11 hydroxy THC et en 8 hydroxy THC, substances également psychotropes, à durée de vie courte, le 11 hydroxy THC s’oxydant en acide 11 nor D9 tétra hydrocannabinol (THC COOH) inactif. Ce dernier composé a une durée de vie plus longue (> 5 jours et jusqu’à deux mois) et se retrouve dans les urines, le sang, les cheveux, la salive….La quantification de ces composés, par GC/MS, permet de savoir si un individu est sous l’emprise de cannabis (applicable à d’autres stupéfiants) et/ou si il est consommateur occasionnel ou régulier. Transportons nous donc au laboratoire…
Principe analytique
Dans le cadre de cet exercice, nous nous intéresserons uniquement à la quantification du THC. Les cannabinoïdes présents dans l’échantillon à analyser sont extraits par adsorption sur une membrane solide (SPMEM : Solid Phase Micro-Extraction Membrane), désorbés par l’éthanol, puis analysés par chromatographie en phase gazeuse (après dérivatisation sous forme d’éthers silylés) couplée à une détection par spectrométrie de masse. Un étalonnage interne est réalisé à partir d’un échantillon référence de THC et d’un étalon interne le coumafuryl, noté EI.
Préparations des étalons
A partir d’une solution mère de THC, notée S0, à la concentration de 1mg/l, on prépare 5 échantillons de solutions étalons (solutions filles dans l’éthanol) dans les conditions présentées dans le tableau ci-dessous
| S mère | V prélevé (ml) | V total (ml) | S fille |
| S0 | 10 | 100 | S1 |
| S1 | 25 | 50 | S2 |
| S2 | 10 | 20 | S3 |
| S1 | 10 | 50 | S4 |
| S2 | 5 | 25 | S5 |
Calculer, pour chacune des solutions ‘filles’ la concentration (exprimée en ng/ml) en THC ainsi que le facteur de dilution par rapport à la solution initiale.
Préparation de la solution d’étalon interne
A partir d’une solution mère d’étalon interne (E.I) à 200 mg l-1, on prépare une solution d’étalon interne par dilution de 10 ml de solution mère à 50 ml dans l’éthanol. Calculer la concentration, en étalon interne, de la solution fille.
Etalonnage interne
Dans un flacon vial de 2 ml, on introduit un volume de V1 de solution étalon de THC, auquel on ajoute V2 de solution d’étalon interne et un volume V3 d’agent de dérivatisation suivant le tableau :
| S étalon | V1 (µl) | V2 (µl) | V3 (µl) | Réf. Echantillon |
| S1 | 500 µl | 250 µl | 500 µl | A |
| S2 | 500 µl | 250 µl | 500 µl | B |
| S3 | 500 µl | 250 µl | 500 µl | C |
| S4 | 500 µl | 250 µl | 500 µl | D |
| S5 | 500 µl | 250 µl | 500 µl | E |
L’analyse des différents échantillons est réalisée par chromatographie en phase gazeuse (CPG), dans les conditions suivantes :
Phase stationnaire : Colonne capillaire DB5 , L = 25 m, diam = 0,32 mm. Film : 0,25 µm Phase mobile : Hélium
Débit : 1ml/mn (élution en mode isotherme) Injection : 1 µl Ratio de Split :10/90
Détection : Spectrométrie de masse
On obtient les résultats suivants :
| Echantillon | Aire chromatographique (THC) | Aire chromatographique (E.I) |
| E | 13000 | 62000 |
| D | 29650 | 61350 |
| C | 60150 | 59580 |
| B | 127500 | 64300 |
| A | 253500 | 57540 |
3a Sachant qu’il existe une relation linéaire entre la masse de soluté injectée dans le chromatographe (mi) et l’aire du pic chromatographique (Ai), Etablir la relation liant la concentration en THC (dans les solutions étalons) et le rapport des aires chromatographiques (ATHC / AEI).
3b Calculer les rapports ATHC / AEI) pour les différents échantillons (A, B…E) et tracer la courbe d’étalonnage
CTHC = f(ATHC / AEI).
3c Que signifie le terme ‘ratio de split’. Quel serait l’impact d’une augmentation d’épaisseur de film sur la rétention des différents solutés.
Préparation de l’échantillon
1 membrane (solide), pré activée, est mise au contact d’un échantillon de 1 ml de sang fraîchement prélevé, pendant 30 mn (phase d’adsorption). Elle est alors séparée de la phase liquide, séchée, puis désorbée par 0,5 ml de solvant de désorption pendant 6 heures. La fraction liquide, contenant le THC, est alors séparée de la fraction solide, volumée à 1 ml avec de l’éthanol et est prête à être analysée par CPG.
Quantification de l’échantillon analysé
Dans un vial de 2 ml, on introduit un aliquote de 500 µl de l’échantillon précédemment préparé auquel on ajoute 250 µl de solution de standard interne et 500 µl de réactif de dérivatisation . Deux injections successives sont réalisées. On obtient, pour le pic du THC et pour l’étalon interne les résultats suivants :
| Injection | Aire chromatographique (THC) | Aire chromatographique (E.I) |
| N°1 | 103500 | 62350 |
| N°2 | 98700 | 58750 |
Calculer, pour chacune des injections, la concentration en THC dans l’échantillon analysé. En déduire la valeur moyenne ainsi que le pourcentage d’incertitude.
Quantification de l’échantillon initial
A partir des données fournies pour la préparation de l’échantillon, en déduire la concentration en THC par ml de sang analysé. Que peut-on en conclure.
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