Comparer la résistance au stress digestif in vitro de micro-organismes

Impact de la croissance en écosystème sur la résistance au stress in vitro de micro-organismes fromagers et comparaison avec les conditions de croissance de laboratoire

L’objectif de cette partie des travaux était de comparer la résistance au stress digestif in vitro de micro-organismes d’intérêt fromager (i) cultivés séparément en milieu synthétique, (ii) cultivés en milieu synthétique puis mélangés, (iii) cultivés séparément en milieu synthétique puis mélangés et inclus dans un gel présure, (iv) cultivés en conditions d’affinage réelles. Nous avons ainsi eu accès à des micro-organismes rentrant en contact avec les mêmes stress digestifs mais différant soit par leur mode de croissance, soit par leur environnement lors de la mise en contact. Le protocole a aussi inclus une validation in vivo sur modèle murin concernant la condition (iv). A l’heure actuelle, il existe une petite dizaine de dispositifs permettant de reproduire artificiellement le tube digestif en intégrant son aspect cinétique (pour revue, voir Guerra et al., 2012). La diversité de ces modèles comprend des designs relativement simples (e.g. mono- compartimental comme le Dynamic Gastric Model (Mercuri et al., 2008)mais comprend également des dispositifs très complexes et difficile à prendre en main (e.g. la combinaison des TIM-1 et TIM-2 et ses 8 compartiments couvrant le tractus digestif quasiment au complet avec notamment 4 de ses réacteurs ensemencés par un microbiote (Minekus et al., 1995 ; Minekus et al., 1999). Le choix de l’utilisation d’un dispositif ou d’un autre est lié aux objectifs de travail. Dans notre cas, le dialogue entre microbiote intestinal et les micro-organismes d’origine fromagère, l’incidence du péristaltisme, ou encore la déconstruction en bouche, n’ont pas été étudiés. Ainsi, nous avons fait le choix de développer notre propre digesteur. Le Digesteur Dynamique Gastro-Intestinal (DIDGI) est constitué de trois compartiments indépendants simulant l’estomac, le duodénum et la suite de l’intestin grêle (jéjunum-iléon). L’ensemble du système est relié à une armoire électronique assurant l’interface entre le dispositif et l’ordinateur. Le pilotage des différents paramètres ainsi que l’affichage des valeurs délivrées par les capteurs est réalisée par le logiciel STORM (Guillemin et al., 2010). Ce dispositif nous permet de contrôler à tout instant : la température, le pH, la composition des fluides digestifs ainsi que le transfert du bol d’un compartiment à l’autre. Le dispositif, entièrement stérilisable, permet de prélever des échantillons dans chacun des compartiments. L’annexe I détaille la composition du DIDGI ainsi que ses paramètres de fonctionnement lors des expérimentations réalisées.

La première partie des travaux nous a permis de constituer deux mélanges de micro-organismes aux potentiels immunomodulateurs opposés et permettant d’obtenir un fromage affiné de type pâte molle. Ces fromages affinés ont ensuite été introduits dans le digesteur selon les mêmes séquences de digestion que les autres conditions listées précédemment. En lien avec la troisième partie des travaux, la capacité de survie des micro-organismes à un stress digestif in vivo a été testée grâces à des souris BALB/c au microbiote standardisé. Cheese is one of the oldest ways of conserving milk: in Northern Europe, evidence of cheese- making activity has been found at sites dating from the sixth millennium BC (Salque et al, 2012). At present, Europe produces around 9000 thousand tons of cheese per annum (Eurostat, 2013), and Europeans eat between 25 and 30 kg of cheese per capita per annum. Given that a gram of cheese contains 108 to 109 living microorganisms on average (Beresford et al. 2001), the annual intake of viable cells can be estimated at 1013 to 1014 per capita per annum. The complexity of microflora depends on the type of cheese. In Cheddar and mozzarella, the microflora is relatively simple and consists mainly of lactic acid bacteria (LAB) and a few species of yeast (Kindstedt et al. 2004; Lawrence et al. 2004). In contrast, the microflora in soft, smear-ripened cheeses such as Livarot or Munster contains a broad, diverse range of bacteria and yeasts (Bockelmann 2002, Irlinger and Mounier, 2009). Thus, a fermented food product like cheese is an important source of diverse microorganisms in the human diet. However, few studies have investigated the survival of the cheese microflora in the gastrointestinal tract. A review of the literature shows that most of the research in this field has focused on Lactobacilli, Bifidobacteria and Propionibacteria (Cousin et al. 2011, Saarela et al. 2000) with a view to find new probiotics or using cheese as a carrier for known probiotics (Gardiner et al. 1999, Saxelin et al. 2010). It has been reported that pH is the major stress factor in the gastric compartment, whereas the presence of enzymes has a negligible effect on the microorganisms (Sumeri et al. 2012).

The impact of the stomach’s hydrochloric acid (HCl) on both Gram-positive and Gram-negative bacteria has been well characterized (Krulwich et al. 2011). In contrast, the impact of bile has been less documented (Begley et al. 2005) and has focused on food-borne pathogens (e.g. Escherichia coli and Salmonella typhimurium (Merrit et al. 2009)) or probiotic candidates (such as the Bifidobacteria and the Lactobacilli (Ruiz et al. 2013). One of the few studies related to cheese-ripening bacteria found that the genus Corynebacterium survived passage through the gastrointestinal tract in human microbiota-associated rats (Lay et al. 2004). Cheese-ripening yeasts (such as Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis and Geotrichum candidum) were found to be able to survive in vitro challenges with acid and bile (Kumura et al. 2004, Lay et al. 2004, Psomas et al. 2001). A recent study of the human gut microbiome by David et al. 2014 showed that live bacteria and fungi from cheese are present and metabolically active in the distal colon. This novel approach to assessing the potential impact of food-related microorganisms and their ability to reach the distal colon needs to be consolidated.

 

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