CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE DES ECORCES DE Embellia concinna

Fractionnement et isolement

Le fractionnement et l’isolement de divers produits s’avèrent longs et difficiles car tous les produits autres que les produits peu polaires se trouvent dans une seule phase. On utilise généralement la technique chromatographique pour toutes les substances d’origine marine, animale ou végétale [28]. La chromatographie est une méthode physique de séparation, basée sur les différences d’affinité que peuvent présenter deux ou plusieurs composés pour deux phases différentes dont l’une stationnaire ou fixe ou adsorbant dans le cas de la chromatographie d’adsorption, l’autre mobile nommée éluant [68]. III-1. Chromatographie sur couche mince (CCM) [55] C’est une chromatographie d’adsorption solide-liquide simple et rapide. L’éluant est constitué soit par un solvant unique, soit par un mélange de solvants, il progresse par capillarité le long d’un adsorbant solide, finement divisé, fixé au préalable sur une matière plastique, ou une plaque de verre ou une feuille d’aluminium. Les composants du mélange sont élués à des vitesses différentes selon leur adsorption derrière le front du solvant. En général, les composants de faible polarité sont entraînés plus vite que les constituants polaires. Chaque composant sera déterminé par sa référence frontale, notée Rf , dans un système chromatographique déterminé.  
 
  Dépôt de l’échantillon

Les échantillons à chromatographier ont été dissous dans un solvant moyennement polaire. A l’aide d’un tube capillaire, environ 0,5µL de l’extrait a été déposé en un point situé à 1cm de l’extrémité inférieure de la plaque CCM. Le diamètre de la tache ne doit pas dépasser 3mm, on laisse 1cm entre le premier dépôt et le bord de la plaque ainsi qu’entre chaque dépôt, puis le dépôt est laissé sécher ; ensuite une seconde application a été faite. Enfin, une marque a été déposée en dessous de chaque dépôt. Les différents extraits F2, F3, et F4 ont été chromatographiés sur couche mince de silice. 33  Développement du chromatogramme La plaque CCM est placée dans la cuve chromatographique en position verticale et la cuve est fermée. Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1cm de l’extrémité supérieure de la plaque, la plaque est retirée de la cuve que l’on ferme et le front du solvant est rapidement marqué à l’aide d’un crayon. Puis, la plaque est séchée avec un séchoir ou à l’air libre.  Révélation Les taches invisibles au rayonnement UV doivent être révélées. L’observation de la plaque aux rayonnements UV de longueurs d’onde λ= 254nm et λ= 365nm ainsi que la pulvérisation de celle-ci à l’aide du révélateur tel que la solution d’acide sulfurique à 50% fera apparaître des taches différentes correspondant aux divers constituants [43]. III-2. Chromatographie Liquide à Basse Pression (CLBP) [82] La chromatographie liquide à basse pression peut être une méthode préparative, elle permet en effet, la séparation des constituants d’un mélange et leur isolement, à partir d’échantillons dont la masse peut atteindre quelques grammes. C’est une chromatographie d’adsorption solide-liquide. L’éluant s’écoule en continu dans la colonne remplie d’adsorbant solide finement divisé. Ceci entraîne l’adsorption et la désorption des molécules d’un mélange déposé à la surface supérieure de l’adsorbant. Les molécules sont éluées par gravité vers la partie inférieure de la colonne à des vitesses différentes selon leur solubilité dans l’éluant et leur affinité pour l’adsorbant. Plus l’affinité du soluté pour l’adsorbant est faible, plus l’élution est rapide et inversement. Il existe deux modes de développement de la colonne : – Analyse par gradient d’élution, si on fait varier la composition du mélange de solvant en augmentant progressivement le pourcentage du solvant le plus polaire – Analyse par élution isocratique dans le cas d’un seul système de solvant Une colonne de longueur et de section variable selon la quantité de l’échantillon est remplie de la phase stationnaire qui est la silice dans notre cas. L’échantillon, en solution concentrée, est déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de l’écoulement continu du système d’élution qui traverse la colonne par gravité. 34 Le fractionnement de l’extrait dichlorométhanique F3 a été fait sur une colonne chromatographique ouverte de gel de silice 35 à 60 mesh. Les choix des conditions d’élution, suivis de la séparation et des rassemblements finaux des fractions ont été basés sur les analyses de la CCM. • Préparation de la colonne : remplissage par voie humide Le remplissage de la colonne par l’adsorbant a été fait par voie humide. La phase stationnaire (gel de silice) a été mise en suspension dans le moins polaire des solvants d’élution et agitée jusqu’à l’obtention d’une suspension homogène. Puis, la verser dans la colonne. • Préparation du dépôt sec L’extrait à chromatographier a été dissous en solution dans un petit volume de dichlorométhane et mélangé à une quantité de silice. Le solvant a été évaporé au bain-marie, à 60°C environ, tout en agitant le mélange. La poudre ainsi obtenue a été déposée soigneusement au sommet de la colonne. • Elution L’éluant a été introduit manuellement par écoulement continu à l’aide d’un entonnoir placé au dessus de la colonne. Pour une élution en mode gradient de solvant, le solvant utilisé en premier est l’hexane le moins polaire. Les éluats ont été recueillis par fractions de 9ml. • Test antioxydant L’activité antioxydante des extraits est évaluée sur des plaques de silice développées puis révélées par le 2,2-diphénylpicrylhydrazyle ou DPPH (figure 7). Ce réactif est un radical libre stable qui, réduit par des capteurs de radicaux, passe du pourpre au jaune, révélant ainsi les composés avec une activité antioxydante [124]. C NO2 NO2 O2N N N• Figure 7 : 2,2-diphénylpicrylhydrazyle (DPPH) 35 100 µg des échantillons ou 5 µg de produits purs ont été déposés sur des plaques Silica gel 60 F254 sur feuille d’aluminium (Merck), et celles-ci ont été développées dans le système d’éluant approprié : C6H12/MeOH (7/3). Les plaques ont ensuite été révélées par une solution méthanolique de DDPH à 2 mg/ml.