CONTRIBUTION A L’ETUDE PHYSICO-CHIMIQUE D’UNE PLANTE
Spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse permet de déterminer la masse moléculaire ou la structure d’une substance. L’identification de structure du composé se fait par analyse des ions provenant de l’échantillon.
Principe
La spectrométrie de masse repose sur l’ionisation et la fragmentation des molécules. Les fragments ainsi produits sont caractérisés par leur m/z. L’ensemble des différents ions de m/z donné permet l’établissement du spectre de masse.
Appareillage
Un spectromètre de masse est constitué de trois parties essentielles: La source d’ionisation L’analyseur L’ensemble collecteur-enregistreur
Source d’ionisation
La source d’ionisation permet la production d’ion moléculaire en phase gazeuse. Il existe différentes méthodes d’ionisation. On peut en citer parmi tant d’autres: Ionisation par impact électronique (EI) Ionisation chimique (CI) Ionisation par bombardement par des atomes rapides (FAB) Ionisation par désorption sur une matrice par effet laser (MALDI) Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) Ionisation par électrospray (ESI) et l’ionisation par nanoélectrospray (nanoESI) Deux méthodes de fragmentation et d’ionisations l’ionisation par impact électronique (EI) et par électrospray (ESI) sont résumées dans ce qui suit : Ionisation par impact électronique (EI -MS) C’est une méthode d’ionisation en phase gazeuse, dans laquelle les molécules entre en collision avec un flux d’électrons de forte d’énergie (70 eV). L’impact d’électron sur une molécule provoque l’expulsion d’un électron créant un ion positif appelé ion moléculaire M , selon la réaction suivante: M + e → M + 2e 12 Lors de cette réaction, l’ion moléculaire acquiert un excès d’énergie (70 eV) apporté par l’électron ionisant, elle est suffisante pour provoquer la réaction de fragmentation qui donne alors naissance à un certain nombre de fragments ioniques ou radicalaires. Par suite, les ions formés sont accélérés par un répulseur (une très forte différence de potentiel est appliquée entre deux électrodes), et possèdent une l’énergie cinétique (Ec). Si m est la masse de l’ion, nous avons: Ec = Vz = 2 1 mv 2 (1.17) Où v représente la vitesse prise par l’ion et z est la charge de cet ion et enfin V est le potentiel du champ électrique. Par conséquent, les énergies cinétiques de tous les ions, à la sortie de cette enceinte, sont identiques, mais leur vitesse diffère en fonction de leur masse et de leur charge. Quelques modes de fragmentations de molécules organiques sont présentés ci-dessous : Composés carbonylés L’ionisation du groupe carbonyle s’effectue préférentiellement sur l’un des doublets libres d’oxygènes. Les ions moléculaires se fragmentent principalement en α du carbonyle : R1 R2 C O R1 C O + R2 ionisation e – R1 + CO R1 R2 C O Composés aromatiques • Réarrangement de Mc Lafferty H H + L’ion formé par le réarrangement de Mc lafferty est un radical cation distonique, c’est-à-dire que la charge et le radical ne sont pas portés par les mêmes atomes. 13 • Réarrangement rétro Diels-Alder + Dans certains cas, cette méthode d’ionisation permet d’avoir des informations structurales importantes. Cependant dans le cas où l’échantillon n’est pas assez facilement vaporisable, on a recours à des dérivations chimiques Ionisation par électrospray (ESI-MS) Cette méthode d’ionisation est douce car l’ionisation des molécules se fait à pression atmosphérique et à température ambiante. Le composé est généralement dissout dans une solution généralement aqueuse comme le mélange des méthanol-eau ou acétonitrile-eau (50/50 ; v/v). La solution est introduite dans la source par l’intermédiaire d’un capillaire très fin porté à haut potentiel (environ 4000 V). Sous l’action d’un gaz nébuliseur (N2), et d’un champ électrique, des charges sont créées, et à la sortie du capillaire, il en résulte un nébulisat (« spray ») de fines gouttelettes (1µ) (figure 6). Figure 6: Principe d’ionisation d’électrospray (source : Gaskell, 1997) [18] Dans le compartiment source où règne une pression égale à la pression atmosphérique, ces gouttelettes rencontrent un flux d’azote chaud à contre-courant qui conduit à l’évaporation progressive du solvant. Il y a alors diminution progressive de la taille de la gouttelette ainsi que, corrélativement, 14 l’augmentation de la densité de charge au sein de la solution. Lorsque la répulsion électrostatique de type colombienne excède la tension superficielle de la gouttelette, celle-ci explose en formant plusieurs gouttelettes fines. Après plusieurs étapes de désintégrations, la densité de charge de la gouttelette devient telle que le champ électrique local, très intense, provoque une désorption par effet de champ. Celle-ci se traduit par la production d’ions en phase gazeuse, physiquement intacts et pouvant porter plusieurs charges (positifs ou négatifs). L’interface entre source et l’analyseur est constituée par une série de lentilles qui réalise, d’une part, la désolvatation complète des ions et, d’autre part, leur activation par collision, phénomène que l’on peut mettre à profit pour obtenir des ions-fragments et donc des informations de structure. Les spectres ESI présentent en général un ensemble de pics correspondant aux ions multichargés de type [M+nH]n+ où M correspond à la masse moléculaire de la molécule analysée, et n au nombre de charges portées par cette molécule ionisée. Puisque les mesures de masse sont effectuées moyennant le rapport m/z, alors plus la charge z augmente, plus la gamme de masse accessible sur un instrument donné est élevée. C’est ainsi que cette méthode a permis de calculer les masses de macromolécules (nucléotides, polysaccharides, polymères synthétiques et protéines jusqu’à 200.000 daltons environ), avec une très grande de précision (1 dalton pour 10000) et une très grande sensibilité (de l’ordre de la picomole). Elle permet d’autre part de fournir de l’ion moléculaire
Analyseur
Ce compartiment permet de séparer les ions en fonction de leur rapport m/z. Analyseur à champ magnétique L’analyseur à champ magnétique est constitué par un tube métallique recourbé et placé dans un champ magnétique. Les ions positifs accélérés entrent dans ce tube et leurs trajectoires subissent une déviation sous l’action de ce champ, et nous obtenons l’égalité suivante: Bzv = r mv2 (1.18) D’après les équations (1.17) et (1.18), on en déduit que: m/z = (1.19) 2V B r 2 2 15 Le rayon r étant constant, il suffit de faire varier le champ magnétique B tout en gardant le potentiel d’accélération V constant, tous les ions seront recueillis successivement sur le collecteur selon le rapport m/z, ainsi le spectre est balayé dans le sens des masses croissantes. Analyseur à temps de vol (TOF, Time of Flight) La séparation dans un analyseur à temps de vol repose sur le fait que des ions de masses différentes, acquis à une énergie cinétique uniforme, ont des vitesses différentes, et donc un temps de vol différent pour parcourir une distance donnée. Les ions sont expulsés de la source d’ionisation par paquets. Ils sont accélérés sous une différence de potentiel V et parcourent à une distance d pour arriver au détecteur. A la sortie, un ion de masse m et de charge totale z aura une énergie cinétique suivante : Ec = 1/2 mv 2 = zV En conséquence, les ions les plus légers ont une vitesse plus grande que les ions plus lourds. L’ion parcourt la distance d en un temps t tel que : t = d/v Des ions de masse m différente, sont accélérés à une énergie cinétique uniforme, auront des vitesses différentes et donc un temps de vol différent pour parcourir une distance donnée. Ce temps de vol t s’exprime alors selon l’expression: (1.20) La mesure de t permet de calculer le rapport m/z, les autres termes de l’équation étant constants. Pouvoir de résolution d’un analyseur à temps de vol Le pouvoir de résolution c’est la capacité du spectromètre à séparer des ions à masses voisines. Ainsi la résolution de l’analyseur TOF est définie selon : (1.21) D’après cette définition, la résolution est d’autant meilleure que ∆t est faible, c’est-à-dire quand la largeur du pic est faible. En d’autres termes, la résolution est d’autant meilleure que tous les ions de R = m m ∆ = 2 t t ∆ (∆t = la largeur à mi-hauteur du pic) t 2 = (m/z).(d2 /2V) 16 même nature, donc de même masse, arrivent dans le laps de temps le plus court au niveau du détecteur. La résolution d’un analyseur TOF peut aller de 100 à 20 000. Les principaux avantages des spectromètres TOF sont la sensibilité, la possibilité de mesurer des très hautes masses, la vitesse de balayage et la simplicité.
INTRODUCTION |
