Dispositifs ultra-sensibles pour le nano-adressage
électrique

L’apport des nanotechnologies pour la biodétection 

L’avènement des puces à ADN

 La génétique, étude de l’hérédité, est une discipline récente de la biologie. La mise en évidence de l’ADN comme support de l’hérédité ne date que de 1943, et sa structure ne fut élucidée qu’en 1953. Le contenu de l’information du génome est porté par l’ADN (Acide désoxyribonu- 

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La taille et la nature des séquences contenues dans le génome détermine la forme et la fonction de l’organisme résultant. Ainsi, la détection de séquences d’ADN constitue un des enjeux majeurs des recherches menées dans le domaine de la biologie moléculaire. Toutefois, mˆeme si la découverte de la structure date de 1953, les avancées les plus importantes dans le domaine n’ont été réalisées que depuis les débuts des années 1970 et plus particulièrement après l’apparition, au début des années 1990, du concept de puce à ADN (”DNA chip”) et plus généralement de biopuces . Ces dispositifs permettent à la fois l’étude du séquen¸cage, des mutations et de l’expression des gènes. Le principe des puces à ADN est basé sur les propriétés d’hybridation de l’ADN. Cette molécule existe sous la forme de deux brins appariés, tous deux constitués d’un enchaˆınement (ou séquence) de 4 bases notées A, T, G et C désignant respectivement l’adénine, la tymine, la guanine et la cytosine. Ces bases peuvent s’associer de fa¸con spécifique en créant des liaisons de type hydrogène entre les bases A et T et entre les bases C et G. Ainsi deux brins d’ADN hybridés sont constitués d’enchaˆınements de bases complémentaires (Cf. Figure 1.1). L’association de deux brins d’ADN présentant des enchaˆınements de bases, des séquences, complémentaires est appelée hybridation. Cette hybridation est très sélective et nécessite une concordance parfaite entre les séquences de chaque brin. Fig. 1.1 – Représentation schématique de la structure de la molécule d’ADN. Les puces à ADN sont généralement constituées d’un support solide sur lequel sont immobilisés des oligonucléotides 1 composés d’un seul brin (ou simple brin) qui constituent des sondes. Le rˆole de ces sondes consiste à reconnaˆıtre et à interagir avec des cibles présentes dans une solution à analyser. Dans le cas d’une hybridation entre les deux brins, la connaissance de la séquence composant la sonde permet de déduire facilement la séquence du brin complémentaire. La détection de la réaction se fait généralement en utilisant un procédé de marquage de la molécule cible avec un composé fluorescent ou radioactif. Ainsi, dans le cas d’une hybridation, ce marqueur permettra de révéler, après lavage de la surface, un signal fluorescent ou radioactif témoignant de l’immobilisation de la cible sur la surface. Le principe de la détection repose donc sur la mise à profit de la sélectivité de la reconnaissance des séquences de la cible et de la sonde. Nous voyons que cette reconnaissance n’est possible que si une séquence complémentaire se trouve sur la surface de la 1Des fragments courts constitués d’un faible nombre de bases puce. La détection d’une séquence d’un brin inconnu de n bases nécessite donc de tester individuellement des sondes dont les séquences correspondent à toutes les combinaisons possibles des n bases complémentaires. L’atout principal des biopuces est de pouvoir procéder sur un mˆeme substrat à l’ensemble de ces tests. Pour cela, on procède à un dépˆot localisé de chaque molécule sonde sur la surface de la puce de fa¸con à constituer un réseau de sites probables pour une interaction avec la cible. L’intérˆet principal de la technique réside dans les dimensions des dépˆots qui sont de l’ordre de quelques centaines, voire de quelques dizaines de microns, ce qui permet de disposer plusieurs milliers de sondes différentes sur des surfaces de quelques cm2 . Cette miniaturisation permet donc d’intégrer sur une mˆeme puce l’ensemble des tests nécessaires à la détection d’un grand nombre d’oligonucléotides. Le deuxième intérˆet de cette miniaturisation est de limiter les quantités de produits nécessaires pour chaque test et donc de limiter les étapes d’amplification du matériel biologique. La figure 1.2 nous montre une image en fluorescence de la surface d’un telle puce. Chacun des spots lumineux correspond à une séquence donnée et peut ˆetre analysé pour quantifier chaque interaction. (a) (b) Fig. 1.2 – (a) Principe de fonctionnement d’une biopuce à ADN. (b) Images en fluorescence de la surface d’un biopuce à ADN. Les spots lumineux témoignent de l’interaction entre les oligonucléotides ”cibles” et les oligonucléotides ”sondes” et permettent d’identifier la séquence des brins d’ADN étudiés. La taille minimale des spots détectables est de l’ordre de 10µm. Toutefois, malgré cette miniaturisation, les dispositifs actuels restent encore limités en ce qui concerne la sensibilité et la sélectivité de la méthode de détection qui nécessite, en particulier dans le cas de la fluorescence, de nombreuses procédures d’analyses d’images et de contrˆoles. Leur évolution reste en grande partie conditionnée par des procédés de traitements de surface et d’hybridation et surtout par les progrès des techniques de structuration. Les perspectives d’évolutions offertes par les nanotechnologies sont particulièrement 

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 Elles permettraient tout d’abord d’augmenter encore la densité de sites d’interactions sur la surface et donc d’augmenter encore la vitesse de séquen¸cage. Par ailleurs, comme nous allons le voir tout au long de ce chapitre, les nanotechnologies offrent des moyens de détection particulièrement sensibles et directement intégrables sur la surface des biopuces permettant une lecture directe, rapide et simultanée de chaque site d’interaction. Enfin, les perspectives ultimes nous permettent d’envisager l’intégration sur la surface de l’ensemble des étapes de traitement, de lavage, et de l’acheminement des composés au niveau de chaque détecteur. Ces manipulations se feraient sur de très petits volumes et sur de très faibles quantités de produits. Ces systèmes qualifiés de ”laboratoire sur puce” (lab on chip) constituent l’étape ultime de miniaturisation offerte par les nanotechnologies. Il est important de noter que le principe des biopuces n’est pas limité au seul cas de l’ADN. Ainsi, le procédé est applicable à tout couple de molécules présentant une affinité réagissant de fa¸con sélective. Il est possible d’utiliser des biopuces pour la détection d’ARN 2 , ADNc, d’enzymes, de peptides, d’anticorps, de protéines au sens large … 

Vers la Post-génomique : les puces à protéines

 L’expression des gènes dans l’organisme se traduit tout d’abord par la production des ARN messagers qui constituent le transcriptome. Ces mˆemes ARN messagers sont quant à eux, à l’origine de la production de protéines dans l’organisme. La ”protéomique” est le domaine qui permet de mettre en relation les produits des gènes (protéines) et le comportement cellulaire. Elle constitue donc l’étape suivante à l’étude du génome. Son but est d’étudier les structures et les fonctions de toutes les protéines codées par le génome et leurs interactions à un moment donné ou sous certaines conditions environnementales. L’analyse protéomique étant focalisée sur le produit final de l’expression des gènes, elle est probablement mieux à mˆeme d’intégrer plus directement les mécanismes de fonctionnement de la cellule, y compris les régulations traductionnelles et post-traductionnelles. Ces régulations post-traductionnelles jouent un rˆole important dans la modulation de l’activité des protéines et un des enjeux de l’analyse protéomique est de disposer de la finesse analytique permettant de prendre en compte ces modifications. Ainsi, le défi de la protéomique consiste à trouver des moyens de mesurer les protéines actives à l’échelle du protéome et de connaˆıtre avec quels composants de la cellule elles interagissent (ADN, ARN, autres protéines et molécules). A l’heure actuelle, les méthodes utilisées pour analyser des protéines (électrophorèse sur gel, digestion enzymatique, spectrométrie de masse,…) restent limitées par leur faible débit, et leur faible reproductibilité. Dans ce contexte les puces à protéines, dont le fonctionnement est similaire à celui que nous avons décrit précédemment convient parfaitement à la détection et l’analyse de protéines. La fabrication de ces puces à des fins d’analyse à moyenne et à grande échelle (toutes les protéines d’un organisme sur une puce) ou à haut débit (une espèce de protéine pour détecter son interaction avec une multitude de ligands) est devenu un enjeu important depuis quelques années. Leur fonctionnement [5] est basé sur l’interaction ligand-récepteur que nous présenterons en détail en Annexe C. Un anticorps est immobilisé sur la surface de la puce. L’interaction d’une protéine avec cet anticorps 2Acide Ribo Nucléique est sélective et permet ainsi de détecter, via un marqueur, la nature de la protéine à identifier.