Fractionnement liquide-liquide de l’extrait brut de Cryptocarya dealbata
Extraction
Après les macérations dans l’éthanol des fruits de Cryptocarya dealbata et des feuilles de Cryptocarya rigidifolia, les solutions alcooliques obtenues ont été évaporées sous vide et les rendements en extraits bruts sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5 : Rendements des extractions Matériel végétal Code Masse poudre (g) Masse extrait (g) Rendement (%) IC50 (µg/ml) Aspect et couleur C. dealbata TST139 350 55,92 15,97 2,18 Pâte marron C. rigidifolia MG442 300 26,9 8,96 4,83 Pâte verdâtre
Fractionnement liquide-liquide
Fractionnement liquide-liquide de l’extrait brut de Cryptocarya dealbata
Après dissolution de 39,6g de l’extrait brut de Cryptocarya dealbata dans 800 ml de MeOH, le mélange a été extrait successivement avec des solvants non miscibles entre eux et a fourni trois fractions : 7,55 g de fraction hexanique (TST139-1) ; 19,63g de fraction acétate d’éthyle (TST139-2) et 10,01g de fraction aqueuse (TST139-3). Les résultats du partage liquide-liquide sont rassemblés dans le tableau 6 et exposés sur le diagramme 2. Tableau 6 : Rendement du partage liquide-liquide de 39,6 g d’extrait brut de C. dealbata Fraction Code Masse (g) Rendement (%) IC50 (µg/ml) Aspect et couleur Hexane TST139-1 7,55 19,06 27,30 Liquide visqueux verdâtre AcOEt TST139-2 19,63 49,57 7,40 Pâte marron Aqueuse TST139-3 10,01 25,27 22,83 Poudre rousse Thèse de Doctorat Chimie des Produits Naturels Faliarivony RANDRIAMIALINORO 46 Diagramme 2 : Résultat du partage liquide-liquide de Cryptocarya dealbata
Fractionnement liquide-liquide de l’extrait brut de Cryptocarya rigidifolia
5 g d’extrait brut de Cryptocarya rigidifolia ont donné, 1481,42 mg de fraction hexanique (MG442-1) ; 764,81 mg de fraction AcOEt (MG442-2) ; 571,46 mg de fraction aqueuse (MG442-3) et 1249,48 mg de fraction insoluble (MG442-4). Les résultats obtenus à partir du partage liquide-liquide de Cryptocarya rigidifolia sont récapitulés dans le tableau 7 et le diagramme 3. Tableau 7 : Rendement du partage liquide-liquide de 5g d’extrait brut de C. rigidifolia Fraction Code Masse (mg) Rendement (%) IC50 (µg/ml) Aspect et couleur Hexane MG442-1 1481,42 29,62 13,82 Liquide visqueux jaune verdâtre AcOEt MG442-2 764,81 15,29 2,89 Pâte rouge marron Aqueuse MG442-3 571,46 11,42 Inactive Pâte rouille Insoluble MG442-4 1249,48 24,98 Inactive Poudre rousse Extrait brut TST139 39,6 g ; 2,18µg/ml Dissolution dans 800 ml MeOH Extraction avec 3×800 ml d’ Hexane Fraction hexanique TST139-1 7,55 g ; 27,30 µg/ml Liquide visqueux verdâtre Phase MeOH Evaporation à sec Dissolution dans 800 ml d’eau à 40°C Extraction avec 3×800 ml d’AcOEt Fraction aqueuse TST139-3 10,01 g ; 22,83 µg/ml Poudre rousse Fraction AcOEt TST139-2 19,63 g ; 7,40 µg/ml Pâte marron Evaporation à sec Evaporation à sec Thèse de Doctorat Chimie des Produits Naturels Faliarivony RANDRIAMIALINORO 47 Diagramme 3 : Résultat du partage liquide-liquide de Cryptocarya rigidofolia 3. Etude phytochimique de la fraction AcOEt de Cryptocarya dealbata (TST139-2) En considérant les résultats obtenus à la suite du test antiplasmodial effectué sur les 3 fractions issues de l’extrait brut de C. dealbata, notre choix s’est porté sur la fraction ayant la meilleur IC50 soit TST139-2 (IC50 = 7,40 µg/ml), pour effectuer une étude phytochimique approfondie.
Fractionnement et isolemen
Chromatographie sur colonne de la fraction TST139-2 3 g de la fraction AcOEt (TST139-2) ont été soumis à un fractionnement sur colonne de gel de Sephadex LH-20. Le système d’élution isocratique CH2Cl2/MeOH (50:50) a été appliqué. Les fractions présentant les mêmes profils chromatographiques sur CCM ont été rassemblées. 7 fractions notées TST139-21 à TST139-27 ont été obtenues (Diagramme 4). Diagramme 4 : Fractionnement sur colonne de Sephadex LH-20 de TST139-2 TST139-2 3 g TST139-21 116,9 mg TST139-22 114,83 mg TST139-23 105,64 mg TST139-24 1772,47 mg TST139-25 186,72 mg TST139-26 106,65 mg TST139-27 15,8 mg Sephadex LH-20 CH2Cl2/MeOH (50 :50) CC Elution isocratique Extrait brut MG442 5 g ; 4,83 µg/ml Dissolution dans 100 ml MeOH Extraction avec 3 x 150 ml de Hexane Fraction hexanique MG442-1 1481,42 mg ; 13,82 µg/ml Liquide visqueux jaune verdâtre Phase MeOH Evaporation à sec Dissolution dans 100ml d’eau à 40°C Extraction avec 3x100ml d’AcOEt Fraction aqueuse MG442-3 571,46 mg ; Inactive Pâte rouille Fraction AcOEt MG442-2 764,81 mg ; 2,89 µg/ml Pâte rouge marron Evaporation à sec Evaporation à sec Fraction insoluble MG442-4 1249,48 mg ; Inactive Poudre rousse Evaporation à sec Thèse de Doctorat Chimie des Produits Naturels Faliarivony RANDRIAMIALINORO 48 3.1.2. Purification de TST139-25 La fraction TST139-25 (186,72 mg) a été analysée par chromatographie sur colonne de silice (50-200 µm) en élution isocratique Hexane/AcOEt (50 : 50) et a permis de recueillir la fraction TST139-25-4. Cette dernière a été par la suite purifiée par chromatographie sur colonne de silice (20-45 µm) en élution isocratique cyclohexane/AcOEt (60 : 40) pour obtenir le composé TST139-25-4A (34,47 mg) (Diagramme 5). Diagramme 5 : Fractionnement sur colonne de TST139-25 3.1.3. Purification de TST139-26 La fraction TST139-26 (106,65 mg) a été soumise à un fractionnement par chromatographie d’adsorption sur silice en élution isocratique (Hexane/AcOEt : 70-30). Deux produits codés TST139-26-1 et TST139-26-2 ont été isolés (Diagramme 6). Diagramme 6 : Fractionnement sur colonne de silice de TST139-26 TST139-25-4A 34,47 mg Silice 20-45 µm Cyclohexane/AcOEt (60 : 40) TST139-25 186,72 mg TST139-25-1 46,26 mg TST139-25-2 2,74 mg TST139-25-3 13,81 mg TST139-25-4 55,89 mg TST139-25-5 6,71 mg TST139-25-6 47,03 mg Silice 50-200µm Hexane/AcOEt (50 : 50) CC Elution isocratique CC Elution isocratique Silice 50-200 µm Hexane/AcOEt (70 :30) TST139-26 106,65mg TST139-26-1 41,32 mg TST139-26-2 33,71 mg TST139-26-3 1,47 mg TST139-26-4 0,96 mg TST139-26-5 2,91 mg TST139-26-6 3,86 mg TST139-26-7 9,93 mg CC Elution isocratique Thèse de Doctorat Chimie des Produits Naturels Faliarivony RANDRIAMIALINORO 49 3.1.4. Purification de TST139-24 Le schéma de fractionnement de la fraction TST139-24 est présenté sur le diagramme 7. Le premier fractionnement par chromatographie sur colonne de silice de la fraction TST139-24 en élution avec gradient de solvant (Hexane/AcOEt de 40-60 à 0-100) a permis d’obtenir vingt sous fractions. La sous fraction TST139-2415 a été ensuite traité par chromatographie sur colonne de silice en élution isocratique hexane/AcOEt (50 : 50). Le composé TST139-2415-4 ainsi obtenu, a été purifié par rinçage et cristallisation avec le mélange cyclohexane/AcOEt (60 : 40) pour donner le composé TST139-2415-4A. Le traitement par chromatographie sur colonne de silice en élution isocratique (hexane/AcOEt : 40-60) de la fraction TST139-2417 a fourni le composé TST139-2417-10. La fraction TST139-24-18 a été partagée par chromatographie sur colonne de silice, utilisant l’élution isocratique (hexane/AcOEt : 40-60) et a donné 5 sous fractions. Les sous fractions TST 139-2418-1, TST139-2418-2 et TST 139-2418-3 ont été regroupées puis purifiées par une chromatographie sur colonne de silice (20-45 µm), en élution isocratique cyclohexane/AcOEt (60 : 40), pour donner le composé TST139-2418-2A.
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