Les techniques d’extraction de l’ADN libre circulant

Extraction ADN libre circulant

La prise en charge des patients atteints d’un cancer au stade métastatique passe aujourd’hui par une caractérisation des altérations somatiques tumorales à la recherche d’une cible thérapeutique potentielle. L’isolement e t l’analyse de l ’ADN tu moral circulant issu de plasma est susceptible d’être utilisé comme approche non invasive pour détecter ces altérations. Mais les résultats analytiques sont très dépendants de l’étape d’extraction qui doit permettre d’isoler efficacement des quantités souvent faibles de matériel et être c. Ces méthode s d’extraction doivent égale ment pouvoir être mises en place facilement à l’hôpital dans le cadre.

Différentes méthodes d’extraction

La technologie d’extraction sur colonne avec membrane de silice est une méthode largement répandue dans les kits d’extraction de laboratoire. L’ADN est adsorbé spécifiquement sur la membrane de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants cellulaires sont éliminés par les différentes étapes de lavage. Des sels chaotropes sont inclus pour aider à la dénaturation de protéines et à l’extraction de l’ADN. L’ADN est finalement élué dans un tampon faible en sel ou tampon d’élution. Depuis quelque s année s, n ous utili so ns au labor at oir e le kit de la so c iété Qi agen : QIAa mp® Cir cula ting Nu cleic Acid ki t, qui fonc ti onne s ur ce princ ipe . Il p ermet de r écupérer d es acide s nu cl éiques f ragmen tés pr és e n ts d an s un volume de plasma a ll ant de 1 à 5m L. Il faut 4 heu res p our extrai re 24 écha nt ill on s. I l est dev enu not re kit de ré férence. C ’est aus La technologi e d’extracti on sur bi lles magné tiq ue est une méth ode b asée su r la liais on réve r sib le de l ’ADN à une surfa ce solide, des billes para magné tiques r ecouver tes d ’une co uche de si li ce. Ap rès liais on s pécifiqu e d e l’AD N, les bil les sont sé parées des au tres c om posants ce llula ires co nta minan Les bille s magnétiqu es li ent l ‘A DN de m aniè re plus eff ica ce que le s membran es de silice, ce qui entra îne des re nd emen ts supérie ur s et p lu s u n ifo rm es. En o utre, il n’ y a pas de r isque d e colmata ge de la memb ra ne au co ur s du proc ess us d’extraction. Ce problèm e de co lmatage est partic ul ièrement pr éoccu pant .

Comme pou r le kit man ue l, le pro tocole c o mporte 4 é tapes : une lyse, u n acc roc hag e de l’ ADN sur le s bil les, de s lavag es e t une élution ( Figure 20). Il peut trai te r 24 échantillons en p ara llèle. De même, l’u tilisation d’ un RNA carrier es t fortement rec ommand ée si on ve ut optimiser la récup érat ion d Le protocol e e st optim isé pou r des grands vo lumes de plasma d e l ’ord re de 4mL avec une é lution dans 70µ L de ta mp on. M ais d ans le ca dre de n otre é tu de nous av ons d écidé de t est er ce kit dans les mê mes condi tions qu e celle s uti l isée s avec la te ch nique ma nue lle Qia gen, c’e st à dire En 2015 , la soci été Pro mega nous a pr oposé de te ster avant commer ci alisati on un nouveau k it d’extra cti on d isponibl e sur le ur a ut omate Maxwel l® R SC : le ccfDNA Pl asma Kit. Il a p o ur obj ecti f de r éc upérer l’A DNlc à pa rti r d’u n volume d e pl asm a très fa ibl e : de 0,2 à 1mL. Le principe de L’avantage d e c et autom ate e st sa simp licité d’utili sat ion. Une e xtract io n perme t de traiter 1 6 éc hantillo ns en 80 m inutes, de p lus il n e p ipette a ucun liq ui de, les b arreaux aimantés se dép lacent touj ours a u-dess us du même écha ntillon donc le ri squ e de contam.