Influence de la longueur de l’aptamère sur le processus de reconnaissance

Influence de la longueur de l’aptamère sur le processus de reconnaissance

Structure secondaire de l’aptamère anti-L-Tym

Hypothèse de départ

le G-quartet Au sein de la séquence d’aptamère anti-L-Tym se trouvent quatre doublets de guanine susceptibles de former une structure en G-quartet (5’-AATTCGCTAGCTGGAGCTTGGATTGATGTGGTGTGTGAGTGC GGTGCCC-3’). Ces quadruplexes sont connus pour se former en présence d’un ion monovalent entre chaque plan de quatre guanines. Des études sur la stabilité de cette structure montrent qu’en présence d’ions Li+ , Na+ et K+ les quartets ont des topologies211, et des températures de fusion (Tm) différentes. Ainsi, les quadruplexes de guanines présentent des Tm plus élevés en présence de K+ qu’en présence de Na+ . En présence d’un ion encore plus petit, le Li+ , la Tm est encore plus basse212 . Nous avons donc envisagé de tirer partie de la méthodologie électrochimique décrite précédemment pour tester l’hypothèse de formation d’un G-quartet en évaluant la reconnaissance de l’aptamère vis-à-vis de sa cible dans des tampons contenant exclusivement soit du K + , du Na+ ou du Li+ . Le tampon de reconnaissance utilisé jusqu’à présent est constitué d’un mélange de 5 mM de Tris pH 7,4, 10 mM de MgCl2 et 50mM de NaCl. Des tampons à 50 mM de KCl et LiCl ont donc été préparés, et des expériences de reconnaissance directe de la L-Tym réalisées.Comme représenté sur la figure 86, quel que soit la nature de l’ion monovalent utilisé, aucune différence d’affinité de l’aptamère pour sa cible n’a pu être révélée. L’hypothèse d’un quadruplexe de guanine n’est cependant pas à exclure définitivement. En effet, aucune information n’indique si la formation d’un G-quartet n’est pas le produit final d’un processus de reconnaissance induit lors de la 0 5 10 15 20 25 30 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 i/i° [D-Apta49] (µM) Influence de la longueur de l’aptamère sur le processus de reconnaissance 90 complexation de la cible. De ce fait, seule l’hypothèse d’une préstructuration en quadruplexe peut être rejetée.

Appariement Watson-Crick

La séquence de 49 nucléotides comprenant 14 % de A, 31 % de T, 16 % de C et 39 % de G, des appariements de type Watson-Crick sont susceptibles de se produire. Le logiciel mfold permet de prédire quatre structures secondaires (Fig 87). Ces structures secondaires possèdent des appariements des côtés 5’ et 3’ de la séquence, impliquant moins de 5 appariements de type Watson-Crick. Les températures de fusion étant néanmoins audessus de la température ambiante, ces appariements sont susceptibles de coexister. D’après cette simulation, le monobrin d’ADN n’a donc pas de structuration dominante en double hélice. Toutefois, ces interactions ne sont pas les seules susceptibles de structurer la séquence. Comme évoqué dans le chapitre I, des appariements de type Hoogsteen, des interactions de type πstacking ou encore des interactions guanine-phosphate peuvent se produire et contraindre l’aptamère à coexister sous diverses conformations secondaires et tertiaires non prises en compte par ce logiciel. Cette simulation a néanmoins l’avantage de proposer une structuration largement rencontrée dans le domaine des aptamères : la structure en tige-boucle. Pour des aptamères dirigés contre des acides aminés ou contre de petites molécules organiques, cette structure présente souvent un site de fixation dans la zone non appariée de la séquence, c’est-à-dire dans la boucle. Quatre structures en tige boucle différentes (TB 1, 2, 3 et 4, fig 88) sont ainsi identifiées dans le cas de l’aptamère anti L-Tym.Toutes ces tiges-boucles contiennent un doublet de guanine. Ces structures ne semblent donc pas compatibles avec la formation d’un quartet : étant donnée l’énergie thermique à apporter pour rompre ces structures, il parait peu probable que la reconnaissance moléculaire de la cible puisse induire une reconfiguration en G-quartet. – Etude de la séquence de reconnaissance Les hypothèses de structuration ne peuvent prévoir qu’une ébauche de structure tertiaire. L’approche développée dans ce travail a d’abord été de muter l’aptamère pour essayer d’identifier les séquences indispensables à la reconnaissance, qu’elles soient structurantes ou impliquées directement dans la reconnaissance. Pour se faire, l’hypothèse du G-quartet a été conservée, et les séquences de nucléotides entre les doublets ont été mutées par des séquences faites uniquement de thymine. Cette approche permet d’empêcher la formation des structures TB 1, 2, 3 et 4 mais aussi d’évaluer le rôle des nucléotides 22 à 28 qui n’interviennent dans aucune structure secondaire (Fig 90).

Détermination des kon des brins réduits

La diminution de Kd avec la taille du brin peut s’expliquer par une modification des constantes cinétiques (kon, koff) de la reconnaissance. La détermination des paramètres cinétiques a alors été entreprise via la technique életrochimique sur goutte tournante. La figure 96.a représente l’évolution des Kd mesurés par cette technique. L’amplitude de variation est dans ce cas de 0,7 à 5,8 µM, soit un facteur 7 entre le D-Apta49 et le D-Apta23, ce qui est similaire aux résultats précedemment obtenus par voltammétrie cyclique dans des conditions non hydrodynamiques. La figure 96.b représente les cinétiques obtenues après injection de 5 µl de 25 µM d’aptamères de 49, 33, 31, 28 et 23 nucléotides à une solution de 5 µM de médiateur et 5 µM de L-Tym. 

Cours gratuitTélécharger le cours complet

Télécharger aussi :

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée. Les champs obligatoires sont indiqués avec *