Mise en évidence de l’activité constitutive des
récepteurs MT1 et MT2 et identification
d’agonistes inverses

Introduction L’étude du récepteur oMT2, aussi bien d’un point de vue pharmacologique, fonctionnel et structurel, nous laisse imaginer que ces récepteurs possédent une activité constitutive. D’une part, en absence de mélatonine, le niveau basal d’AMPc des cellules CHO-oMT2 est élevé. D’autre part, le récepteur oMT2 contrairement aux autres récepteurs mélatoninergiques possède un motif DRY. Ce motif DRY situé entre le troisième domaine transmembranaire et la seconde boucle intracellulaire, est hautement conservé au cours de l’évolution. Cette séquence de trois acides aminés joue un rôle primordial dans la régulation des états d’activation des RCPG. Il est acquis que le motif DRY est impliqué dans l’activité constitutive de plusieurs récepteurs, comme les récepteurs α1B et β2B-adrénergiques (Ballesteros et al., 2001; Rasmussen et al., 1999; Scheer et al., 1996), le récepteur à l’histamine H2 (Alewijnse et al., 2000), la rhodopsine (Acharya and Karnik, 1996; Cohen et al., 1993; Franke et al., 1992), les récepteurs à la vasopressine de type II (Morin et al., 1998), les récepteurs μ-opioides (Li et al., 2001), et les récepteurs à l’ocytocine (Favre et al., 2005) (Pour revue: Rovati et al., 2007). L’activité constitutive des récepteurs MT est très peu décrite dans la littérature. Roka et ses collaborateurs ont montré que le récepteur hMT1 exprimé dans la lignée cellulaire HEK293 serait constitutivement actif (Roka et al., 1999). Cette équipe conclut que le luzindole, connu comme étant un antagoniste des récepteurs mélatoninergiques, se comportait comme un agoniste inverse pour ce récepteur. De plus, le récepteur hMT1 formerait de façon spontanée un complexe avec une protéine Gi et une protéine régulatrice de la signalisation des protéines G (RGS20) (Maurice et al., 2010). Ce pré-couplage avec les protéines Gi est un bon argument en faveur de la possible activité constitutive de ce récepteur. De plus, dans des cellules COS co-transfectées avec le récepteur MT1 et le récepteur à la TSH, l’expression du récepteur MT1 diminue l’activation de la voie AMPc induite par la TSH, même en absence de mélatonine dans le milieu. Ceci implique que les récepteurs MT1 non liés peuvent induire une diminution de la signalisation AMPc (Dupre et al., 2011). Nos travaux se sont portés initialement sur l’activité constitutive des récepteurs mélatoninergiques MT1 et MT2 de trois espèces (humain, rat et ovin). L’activité constitutive a été mise en évidence en mesurant le niveau d’activité des protéines G en absence de ligand endogène (test de liaison du GTPγS). Nous nous sommes alors interrogés d’une part sur la nature du(des) sous-type(s) de protéines G impliquées dans cette activité constitutive et d’autre part sur les facteurs pouvant moduler le niveau de celle-ci. Deux molécules initialement connues comme des antagonistes des récepteurs à la mélatonine, UCM 549 et UCM 724, ont été identifiées comme étant des agonistes inverses des récepteurs humains MT2 (Spadoni et al., 2007). Dans la première étude, seuls les résultats concernant les récepteurs MT1 et MT2 humains exprimés de façon stable dans les lignées cellulaires CHO et Neuro2A sont présentés. Dans la seconde étude, l’activité constitutive des récepteurs de rat et ovin seront exposés .

Discussion

The constitutive activity of MT receptors is poorly documented. A close examination of the three experimental papers dealing with this subject leads to a different conclusion. Indeed, human MT1 (not MT2 ) receptor has been described in 1999 by Roka et al. [16] in full mechanistic details, including some data on luzindole inverse agonism. In a second paper [24], it is reported that in isolated rat caudal arteries, in which MT1 receptors are expressed, the treatment of the system with 4P-PDOT decreases the basal GTP binding by 30%. Interestingly, the inhibition is inversely proportional to the concentration of the compound (while clearly seen at 100 nm, it is more modest at 1 lm and not significant at 10 lm). A feature that shade some concerns onto the conclusion, which stated that 1/MT1 is constitutively active and 2/4P-PDOT is an MT1 inverse agonist, while initially described as a MT2 full antagonist [4]. Finally, the third and most recent publication deals with a further description of two human MT1 cell lines expressing either high (158 fmol/mg prot) or low (88 fmol/mg prot) concentrations of receptors and that show MT1 receptor constitutive activity or not, respectively [25]. The paper further described the internalization of the receptor that rendered the exact quantification and qualification of the process difficult. In summary, various reports state that MT1 was constitutively active, including, indirectly, in native tissues, but no report exists on the status of MT2 . On the other hand, 4PPDOT, a former MT2 receptor antagonist, and luzindole, a MT1/MT2 receptor ligand, were both reported as MT1 inverse agonists. With these data available, we felt that there was some place for clarification of the constitutive activity of melatonin receptors, including a search for inverse agonists, despite a statement in the most recent reference review on the subject [4], which postulates that it is now well accepted. This view seems, therefore, a little ahead of our time, because there is still some place for experiments to further document this subject. In our CHO system, but also when expressed in Neuro2A cells, we confirm that MT1 is constitutively active, and, for the first time, we show that MT2 receptors are also constitutively active when expressed in the same cells. The level of their constitutive activity is in line with what has been reported in the literature for MT1 , and, for the sake of orthogonal comparison, for H3. As discussed before in this section, the experimental data supporting an inverse agonism of 4P-PDOT and luzindole, all come from a single laboratory, were scarce and, at least, arguable, in particular because the experimental models used were complex, and the readout not specific of melatonin receptors [24, 45, 46]. Besides published results [47], one of our own reports [34] showed that these compounds are in fact partial agonists at melatonin receptors, using either [35S]-GTPcS or the CDS technology. To identify new compounds with inverse agonism, we relied on the long-standing activity of medicinal chemistry of melatoninergic ligands, which yielded a variety of chemical series, bearing either agonist or antagonist activities. Noteworthily, the inverse agonist property of a ligand appears only when dedicated experimental set-up are used, i.e., where the receptor does show constitutive activity, and when the data processing can adequately detect reverse effects of the compounds on the basal signal. If these experimental requirements are not met, a genuine inverse agonist will appear with simple antagonist properties. Indeed, a retrospective analysis of marketed drugs with attached antagonist properties showed that 70% of them did have, in fact, an inverse agonist profile, when evaluated in the appropriate conditions [reviewed in Ref. 48]. Our prospection led to the identification of two compounds that behave as inverse agonist to MT2, while they have a simple antagonist profile on MT1 receptors. These compounds can now be considered as new tools to investigate the constitutive activity of melatonin receptors in different experimental systems.