Polysaccharides Hétérosides Hydroxyanthracénique

Méthodes chimiques d’études des polysaccharides (PS)

Isolement du PS

L’isolement du polysaccharide comporte les étapes ci-après :

 1ère étape : nettoyage

Un nettoyage préalable soigné des feuilles est nécessaire pour les débarrasser de toute souillure extérieure.

2ème étape : obtention du PS brut

Elle consiste en une extraction du gel mucilagineux par précipitation à l’EtOH 50%. Après élimination des impuretés par centrifugation, on procède à deux nouvelles précipitations successives à l’EtOH 96%.

3ème étape : purification du PS

L’opération précédente est suivie d’une dialyse. Le schéma 5 résume les différentes étapes citées. Par ailleurs, les détails de la manipulation sont rapportées dans la partie expérimentale. Pour l’étude comparative de deux espèces d’aloès, on procède exactement de la même façon pour aboutir aux PS respectifs. (Schéma 5)

 Dialyse

La dialyse est basée sur le phénomène d’osmose. La membrane utilisée laisse passer les polysaccharides à faible poids moléculaire (petites molécules) tout en retenant ceux à haut poids moléculaire, soit les plus volumineux. La vitesse de diffusion est inversement proportionnelle au poids moléculaire avec 0<Kd<1 où Kd est la constante de diffusion [26,28]. La dialyse est une technique d’ultrafiltration qui permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores de la membrane de dialyse. Elle est effectuée contre de l’ED sous agitation continue pour éviter la formation d’un gradient de concentration 

Hydrolyse

On connait trois sortes d’hydrolyse qui sont applicables aux liaisons glycosidiques :

– autolyse

– hydrolyse alcaline

– hydrolyse acide

L’hydrolyse acide représente la méthode de choix pour réaliser la rupture des liaisons osidiques. Les oses sont, en effet, généralement stables en milieu acide. Les acides concentrés sont exceptionnellement utilisés pour hydrolyser des liaisons osidiques particulièrement stables : cas de la chitine.Les acides chlorhydrique et sulfurique, à des concentrations variant de 0,01 à 4N, sont couramment utilisés pour hydrolyser totalement les liaisons osidiques. La température d’hydrolyse varie de 80 à 100°C et la durée, de quelques minutes à plusieurs heures.

Réduction 

Les PS monosaccharides obtenus issus de la réaction d’hydrolyse peuvent être réduits en alditols. Pour cette opération, on utilise couramment le NaBH4 qui sera ensuite détruit par addition d’acide acétique.

Acétylation

L’acétylation des monosaccharides est une méthode courante d’étude de ceux-ci. Elle a pour objet de les rendre volatiles. Ils subissent une réduction préalable à la peracétylation.Les alditols peracétylés seront analysés en cpg.

Schéma 2 : Mécanisme réactionnel de l’acétylation On réalise l’acétylation des fonctions hydroxyles à l’aide de l’anhydride acétique, dans la pyridine comme solvant. La réaction est quantitative avec les alcools primaires et secondaires ; elle est plus lente et non quantitative avec les alcools tertiaires.

ccm 

La ccm donne des renseignements préliminaires sur les caractéristiques des sucres et de leurs dérivés. C’est une technique très simple, rapide qui présente l’avantage d’être sensible à un degré souvent élevé. Elle est classée parmi les chromatographies liquide-solide. Elle emploie une phase stationnaire solide ou adsorbant et une phase mobile liquide. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui progresse le long d’une phase stationnaire déposée en un film fluorescent à la lumière UV. La substance à analyser est déposée sur la phase stationnaire et le développement se fait à l’aide d’un solvant approprié. Les différents composés migrent à leur propre vitesse derrière le front du solvant et leur emplacement est repéré par l’observation de la plaque sous UV (λ = 254nm et 365nm). Ils sont ensuite révélés à l’aide d’un réactif approprié. Chaque constituant est caractérisé par sa référence frontale ou « Retarding factor » notée Rf.

Distance parcourue par le solvant

Dans le cas des oses, l’adsorbant utilisé est le gel de silice. Plusieurs réactifs de révélation peuvent être utilisés mais le plus courant est l’orcinol sulfurique.Les produits ayant des Rf faibles, retenus par l’adsorbant sont les produits polaires tandisque ceux ayant des Rf élevés sont les moins polaires. Dans le cas présent, il s’agit d’une chromatographie à phase normale.

cpg 

Selon le procédé de Sawardeker, Sloneker et Jeanes, les dérivés peracétylés des alditols sont analysables en cpg. Cette méthode offre l’avantage de conduire à des diagrammes simples puisque les formes α, β et γ des oses sont éliminées [34]. La cpg permet de déterminer les divers constituants d’un échantillon. Les différents composants sont identifiés par leur temps de rétention en les comparant à ceux des produits étalons pris dans les mêmes conditions. Les temps de rétention d’un tel composant est le temps mis par ce dernier pour parcourir la colonne de l’injecteur vers le détecteur. Les substances à analyser sont à l’état gazeux et thermostables. Le phénomène mis en jeu peut être l’adsorption si la phase stationnaire est solide, le partage si celle-ci est liquide. La phase mobile est un gaz inerte présentant l’avantage de permettre l’utilisation de système de détection physique extrêmement sensible de l’ordre de 10-2 g. Elle se prête à une application à la fois qualitative et quantitative  L’appareillage comporte :– une source de gaz un injecteur– un four– une colonne– un détecteur– un enregistreur

Equilibre triangulaire Glc-Man-Fru [26, 43]

En solution basique diluée, les aldoses et cetoses subissent des réarrangements lesquels dépendent des structures de leurs hydroxyaldéhydes ou hydroxycétones. L’interconversion Glc-Man est une réaction d’épimérisation. Le réarrangement complet est la réaction dite de LOBRY de BRUYN-Van EKENSTEIN. Elle se produit par énolisation du Glc pour conduire à l’ènediol. Ce dernier se cétonise de trois manières différentes:en Glc (57%)en Man (3%)en Fru (28%).Le mécanisme de cette épimérisation est présenté à la page suivante .