Processus biologiques impliqués dans la physiopathologie de l’ostéochondrose équine

Développement d’une méthode d’analyse protéomique de l’os et du cartilage

Dans un premier temps, afin de réaliser notre étude protéomique à partir d’échantillons d’os et de cartilage épiphysaire de cheval, nous avons mis au point une technique d’analyse basée sur l’électrophorèse bidimensionnelle. En effet, l’analyse protéomique d’os et de cartilage constitue un véritable challenge en raison de la structure et des propriétés biochimiques de ces deux tissus. Les différentes méthodes décrites jusque-là étaient réalisées à partir de cellules ou d’explants en culture [126], limitant les études relatives à la biologie in vivo des chondrocytes et à l’homéostasie de la MEC. Nous avons donc développé une méthode simple et efficace basée sur une extraction des protéines au phénol, une électrophorèse bidimensionnelle, une coloration des gels au nitrate d’argent puis une identification des protéines par LC-MS/MS. Cette méthode ne nécessite ni mise de mise en culture qui pourrait induire d’éventuelles modifications physiologiques, ni fractionnement qui pourrait réduire la reproductibilité. Elle permet donc d’étudier le protéome d’échantillons d’os et de cartilage collecté in vivo, en conditions physiologiques normales. Nous avons pu identifier ces protéines issues de plusieurs compartiments cellulaires prouvant ainsi que la procédure pouvait être utilisée pour des études moléculaires in situ des contenus cellulaires des chondrocytes, des ostéoblastes, des ostéoclastes et de la matrice extracellulaire à l’exception des protéoglycanes. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans la revue Proteomics : Proteomic analyses of cartilage and, to a lesser extent, of bone have long been impaired because of technical challenges related to their structure and biochemical properties. We have developed a unified method based on phenol extraction, 2DE, silver staining, and subsequent LC-MS/MS. This method proved to be efficient to characterize the proteome of equine cartilage and bone samples collected in vivo. Since proteins from several cellular compartments could be recovered, our procedure is mainly suitable for in situ molecular physiology studies focused on the cellular content of chondrocytes, osteoblasts, and osteoclasts as well as that of the extracellular matrix, with the exception of proteoglycans. Our method alleviates some drawbacks of cell culture that can mask physiological differences, as well as reduced reproducibility due to fractionation. Proteomic comparative studies between cartilage and bone samples from healthy and affected animals were thus achieved successfully. This achievement will contribute to increasing knowledge on the molecular mechanisms underlying the physiopathology of numerous osteoarticular diseases in horses and in humans.

Etude protéomique comparative de l’os sous-chondral et du cartilage épiphysaire de chevaux sains et atteints d’OC

La méthode d’analyse protéomique de l’os et du cartilage m’a permis de comparer le protéome de l’os sous chondral et du cartilage épiphysaire non lésés de chevaux sains et atteints d’OC, soumis ou non à une compression expérimentale. Au préalable, une classification des lésions d’OC a été effectuée à partir de caractéristiques histologiques et de biomarqueurs métabolomiques du liquide synovial des articulations atteintes. Alors qu’au plan clinique les individus atteints sélectionnés paraissaient homogènes, lors de la nécropsie, nous avons observé trois types de lésions. Deux poulains présentaient des lésions de type « coup d’ongle » associé à une griffure du cartilage articulaire, deux autres avaient un fragment de cartilage partiellement détaché de l’os sous-chondral et le dernier poulain présentait une perte importante de cartilage, jusqu’à l’os sous-chondral. Les analyses histologiques ont confirmé l’hétérogénéité observée et nous ont permis de classer les lésions en deux catégories : les « scratches » associées à une invagination du cartilage articulaire sous l’os sous-chondral adjacent et les « fractures » associées à une rupture entre le cartilage articulaire et l’os sous-chondral. Les caractéristiques histologiques de ces lésions laissent à penser qu’il y aurait deux grands types lésionnels différents. Pour les « scratches », les observations histologiques suggèrent soit qu’il s’agit de lésions de type kystes-like à des stades d’évolution différents (précoce et tardif) soit qu’il s’agit de lésions différentes. L’étude protéomique comparées à confirmer l’hétérogénéité observée, en particulier entre individus atteints, mais en cohérence avec les types lésionnels identifiés en histologie. Cela suggère l’existence de types lésionnels différents et réduit la puissance de notre dispositif. Il a toutefois été possible de mettre en évidence des protéines présentant une expression différentielle entre l’os et le cartilage de chevaux sains et atteints d’OC, certaines étant communes aux deux types de lésions et d’autres étant spécifiques Globalement, nos données d’histologie, de métabolomique, de protéomique et de microCT ont permis de définir au moins deux types de lésions (fractures et scratches) impliquant des mécanismes moléculaires communs et spécifiques. Un défaut constitutif du cartilage semble être principalement impliqué dans la physiopathologie des lésions de type fracture alors que des défauts à la fois de l’os sous-chondral et du cartilage apparaissent être à l’origine des scratches. En effet, les chevaux atteints d’OC présentent une structure anormale de la matrice cartilagineuse en lien avec un défaut d’homéostasie. De façon plus spécifique, les lésions de type fracture semblent résulter d’un défaut d’hypertrophie des chondrocytes conduisant à une minéralisation anormale de la MEC. Chez les individus atteints de lésions de type scratches, une densité osseuse moins importante qui semblerait résulter d’un défaut de vascularisation de l’os sous-chondral et d’une perturbation du métabolisme osseux a été observée.