Rôle des gènes RIM et VPS dans la signalisation du pH

Depuis 25 ans, l’incidence des infections fongiques profondes ne cesse d’augmenter parallèlement à l’augmentation du nombre de patients à risque et à l’amélioration de la survie de ces patients. Les infections à levures, principalement Candida albicans, sont les plus fréquentes. La pathogénie de ces infections est dominée par la séquence colonisation – infection locale – dissémination. Dans des conditions favorables comme la modification de la flore bactérienne, l’existence de matériel étranger, l’immunodépression ou l’altération des barrières épithéliales, la colonisation s’installe et peut évoluer vers l’infection. C. albicans est une levure habituellement commensale dotée d’importantes facultés adaptatives lui permettant de survivre dans des microenvironnements différents et ainsi de coloniser ou d’infecter de nombreux tissus de l’organisme. La réponse de la levure à différents signaux environnementaux tels que la quantité de nutriments, la température ou le pH est un des éléments essentiels de la pathogénie de C. albicans. Cette réponse est régulée par différentes voies de signalisation plus ou moins intriquées. Il semble de plus en plus évident que la voie d’endocytose, connue jusqu’ici pour assurer la dégradation et le recyclage des protéines membranaires, joue un rôle dans la transduction des signaux et donc dans la physiologie de la cellule.

Les levures sont des champignons microscopiques unicellulaires se multipliant par bourgeonnement. Le genre Candida regroupe environ plus de 300 espèces dont une faible proportion seulement est potentiellement pathogène. Sur le plan taxonomique, les Candida sont classés parmi les Ascomycètes. Les Candida sont des levures non pigmentées, non capsulées, ovoïdes dont la taille varie de 3 à 15 µm. Les levures asexuées présentant ce phénotype ont été classées historiquement dans le genre Candida. Ce genre est clairement polyphylétique car il comprend des espèces appartenant à deux groupes ayant divergé il y a plus de 150 millions d’années (Dujon 2004, Galagan 2005). C. glabrata est plus proche de Saccharomyces cerevisiae que de C. albicans qui est plus proche de Debaryomyces hansenii .

Morphologiquement, C. albicans se caractérise par sa capacité à former des filaments vrais ou hyphes qui jouent un rôle important dans sa virulence. Les hyphes sont formés à partir des tubes germinatifs par croissance apicale et sont définis par leur mode de division. Lorsqu’il a atteint une taille suffisante, l’article terminal se clive par scissiparité. Des septa percés de micropores permettent une continuité cytoplasmique et séparent les cellules mères des cellules filles en formant parfois des branchements . Ces hyphes « vrais » sont à distinguer des pseudohyphes formés par la plupart des espèces de Candida. Ceux-ci résultent d’un processus de bourgeonnement polaire. Le bourgeon s’allonge et les cellules mère et fille restent solidaires mais il n’y a pas de continuité cytoplasmique (Moore 1998, Calderone 2002) . La formation de chlamydospores est également une caractéristique morphologique de C. albicans. Ce sont des cellules rondes, à paroi épaisse, réfringentes qui apparaissent au bout des hyphes ou des pseudohyphes de C. albicans sous certaines conditions de culture (milieu pauvre et micro-aérobie) . Le rôle de ces chlamydospores n’est pas bien établi mais semble peu important dans la physiopathologie des infections, cette forme n’étant que très rarement retrouvée dans les tissus pathologiques (Chabasse 1988).

Le génome de C. albicans est aujourd’hui entièrement séquencé et disponible sur http://candida.bri.nrc.ca/candida/index.cfm?page=Ca20assembly (Jones 2004). Il a été déterminé à partir de la souche type SC5314, issue d’un isolat clinique. Ses dérivées (CAI-4, BWP17) sont utilisées comme références dans la plupart des analyses moléculaires et des études de virulence sur modèle animal. Le génome de 16 Mbases environ, comprend entre 6000 et 7000 gènes répartis sur 8 chromosomes : le chromosome R (le plus grand) et les chromosomes de 1 à 7 par ordre de taille décroissante. Ce génome diploïde présente deux caractéristiques principales : un très grand polymorphisme allélique, qui concerne 30 % des gènes, et un code génétique alternatif traduisant le codon CUG en sérine au lieu de leucine. Ce codon alternatif est retrouvé dans deux tiers des gènes (Jones 2004). Pour certains, le polymorphisme allélique, qui est supérieur à celui observé dans le génome humain, permet d’augmenter la diversité génétique et pourrait contribuer aux capacités adaptatives de C. albicans ainsi qu’à l’acquisition des résistances aux antifongiques (Yesland 2000, Cowen 2002). La génomique comparative a permis de mettre en évidence chez C. albicans : d’une part des gènes qui n’existent pas dans les levures non pathogènes comme par exemple Saccharomyces cerevisiae et d’autre part des gènes retrouvés dans des organismes beaucoup plus éloignés. Ces gènes présentent un intérêt majeur dans l’étude de la pathogénicité de C. albicans (Jones 2004). La mise en évidence d’un locus sexuel MTL (Mating Type Locus), découvert par homologie à certains gènes des loci sexuels MATa et MATα de S. cerevisiae, et la réalisation de conjugaisons aboutissant à des souches tétraploïdes a remis en cause le caractère asexué de C. albicans. Cependant, une méiose complète permettant le retour à l’état diploïde n’a jamais pu être observée (Hull 2000, Magee 2000, Bennett 2005). Seul un cycle dit « parasexuel », assurant le retour à l’état diploïde par perte chromosomique au cours des mitoses a été obtenu (Bennett 2003). Le caractère diploïde de C. albicans, le code génétique alternatif et l’absence de cycle sexué complet associés à un faible taux de transformation de l’ADN limitent les possibilités de manipulations génétiques et réduisent le nombre de mutants disponibles pour l’analyse fonctionnelle des gènes.

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La paroi des champignons est indispensable à leur survie car elle assure le maintien de leur intégrité, de leur forme cellulaire et les protège des agressions mécaniques et chimiques. Elle joue un rôle essentiel dans les interactions avec les cellules de l’hôte et est donc déterminante pour la virulence (Ruiz-Herrera 2006). Elle est composée majoritairement de polysaccharides (90%) associés à des protéines et des lipides. Les polysaccharides regroupent des mannoprotéines (polymères de mannose liés covalemment à des protéines), des glucanes (polymères de glucose) et, pour la plupart des champignons, de la chitine (polymère de N-acétylglucosamine).

Chez C. albicans, la paroi représente environ 30 % du poids sec de la levure et est constituée de 35-40 % de mannoprotéines, 60 % de glucanes, 1 à 3 % de chitine et 1 à 7 % de lipides (Kapteyn 2000, Chauhan 2002). Sa composition varie avec la morphologie de la cellule : la forme filamenteuse comprenant plus de chitine, plus de β 1,6 glucanes et moins de mannoprotéines que la forme levure. Les glucanes sont séparés en 3 fractions représentant chacune respectivement 25 %, 5 % et 35 % (Chauhan 2002) :
• une soluble à pH alcalin comprenant principalement des β 1,3 glucanes,
• une insoluble à pH alcalin mais soluble dans l’acide acétique et comprenant surtout des β 1,6 glucanes,
• une insoluble à pH alcalin ainsi que dans l’acide acétique comprenant surtout des β 1,3 glucanes liés à la chitine.

La paroi est organisée en plusieurs couches. Les mannoprotéines constituent l’élément principal de cette architecture en formant des blocs avec les glucanes et la chitine et reliant l’ensemble à la membrane plasmique  grâce aux protéines à ancre GPI . Un autre modèle place les β 1,3 glucanes au centre de la structure .

Les mannanes constituent les marqueurs antigéniques de C. albicans. Ils sont liés covalemment aux protéines de la paroi par N-glycosylation et O-glycosylation. Au cours de la N-glycosylation, de nombreux résidus mannoses sont ajoutés en formant des chaînes latérales dont la composition (longueur, branchement, phosphorylation) détermine la spécificité antigénique et permet de distinguer les différents sérotypes de C. albicans. La N- et O-glycosylation ont été impliquées toutes deux dans la transition levure-hyphe et dans la virulence de C. albicans, la O-glycosylation semblant avoir un rôle spécifique dans l’adhésion aux tissus (Timpel 1998, Southard 1999). Au contraire de S. cerevisiae, les mannoprotéines de C. albicans et de C. glabrata portent un type de mannanes particuliers, les β 1,2 mannanes qui ont été impliqués dans les interactions avec l’hôte (récepteur galectine-1) (Poulain 2002).

Les protéines pariétales dont les fonctions sont connues sont des enzymes, des récepteurs ou des adhésines. Elles sont liées de façon covalente aux β 1,3 glucanes soit directement, ce sont les protéines Pir (proteins with internal repeats), soit par l’intermédiaire d’un β 1,6 glucane et d’une GPI (Kapteyn 2000, Chauhan 2002). Les protéines à ancre GPI regroupent des protéines aux fonctions importantes : les adhésines de la famille Als, Hw1p qui joue également un rôle dans l’adhésion et dans la filamentation, Phr1p et Phr2p (homologues de Gas1p de S. cerevisiae et Gel1p d’Aspergillus fumigatus) qui sont impliquées dans l’assemblage de la paroi et la filamentation pH dépendantes (voir plus loin) (Hoyer 1999, Fonzi 1999, Staab 1999, Mouyna 2000). Seules 10 % de la centaine de protéines à ancre GPI, prédites sur la base de la séquence génomique, ont pu être caractérisées et plus de 60 % ont encore une fonction inconnue (de Groot 2003, Eisenhaber 2004). La fonction des protéines Pir est encore mal définie.

Table des matières

Introduction
Généralités sur Candida albicans
Caractères généraux de la levure Candida albicans
La paroi : structure et biosynthèse
Les mannoprotéines
Les glucanes
(1)les β 1,3 glucanes
(2)les β 1,6 glucanes
La chitine
Les lipides
Les infections
Épidémiologie
Physiopathologie et « facteurs de virulence »
Morphogenèse
Autres facteurs de virulence
Aspects cliniques
(1)Candidoses superficielles
(2)Candidoses profondes
Traitement : Mode d’action des antifongiques et mécanismes de résistance chez C. albicans
Mécanismes moléculaires et cellulaires de la résistance
Les principales classes d’antifongiques
Les polyènes : amphotéricine B et nystatine
La 5-Flucytosine
Les azolés
Les échinocandines
Régulations globales des résistances
La voie de signalisation du pH chez les champignons
Voie conservée
Activation de la voie Pal/Rim
(1)Transmission du signal
(2)Protéolyse de PacC/ Rim101p
Effecteurs de la voie Pal/Rim
Rôle dans la virulence chez C. albicans
La voie d’endocytose
La voie MVB
Activation de la voie MVB
Rôle de la voie d’endocytose dans la voie de signalisation du pH
Implication des protéines de la voie MVB dans l’activation de Rim101
Modèle de la participation de la voie MVB à la signalisation du pH
chez C. albicans
Implication de la voie d’endocytose dans la constitution de la paroi et la sensibilité aux antifongiques
Projet de thèse et résultats
Article 1
Article 2
Article 3
Conclusion

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