The unique features of proteins depicting the chicken amniotic fluid

Résumé 

 Chez la plupart des amniotes, le fluide amniotique protège l’embryon face aux agressions physiques (chocs, déshydratation, adhésion aux membranes) et microbiennes. Cette défense contre les pathogènes réside essentiellement dans la présence de protéines et de peptides antibactériens mis en évidence en particulier dans le fluide amniotique humain. Toutefois, la présence de telles protéines n’a jamais été vérifiée dans le fluide amniotique d’œuf d’oiseau, dans lequel l’embryon se développe indépendamment de la mère. Chez la poule, les premières études sur le contenu de ce fluide ont souligné les changements drastiques de sa composition protéique, apportés par le transfert du blanc d’œuf à partir du 12ème jour d’incubation. En revanche, à l’inverse de l’humain, les urines de l’embryon ne sont pas sécrétées dans la poche amniotique, ce qui suggère que le profil protéique du fluide chez l’oiseau pourrait être significativement différent de celui de l’humain. L’analyse par spectrométrie de masse du fluide amniotique chez la poule a mené à l’identification de 91 protéines avant le transfert du blanc (11ème jour d’incubation). Celles-ci semblent essentiellement associées au métabolisme des lipides et des vitamines (les apolipoprotéines, l’albumine sérique, l’alpha-foetoprotéine, etc.), la morphogenèse (collagènes, protéases, etc.) et la réponse immunitaire (principalement le lysozyme et l’ovotransferrine). Les nombreux effecteurs du système immunitaire identifiés dans le fluide amniotique ont déjà démontré leur potentiel antibactérien chez l’oiseau (l’ovomucine, la protéine TENP, la protéine de liaison aux acides gras extracellulaires, l’ovalbumin-related protein X, l’ovoinhibiteur, l’ovomucoïde et la midkine), mais leur faible concentration au 11ème jour d’incubation suggère que l’implication du fluide amniotique dans la défense de l’embryon reste peu significatif à ce stade. En revanche, le transfert des protéines du blanc dans le sac amniotique accroit la concentration en molécules antibactériennes, en amenant, entre autres, un ensemble de nouvelles protéines et peptides antibactériens : la protéine de la membrane vitelline externe n°1, la bêta-défensine aviaire 11, la bêta-microséminoprotéine, l’ovocléidine-17, etc. Cette relocalisation des défenses autour de l’embryon améliore l’activité anti-Listeria monocytogenes (bactérie gram positive) du fluide, et entraine l’apparition d’une activité anti-Salmonella enterica Enteritidis (bactérie gram négative), une bactérie responsable de toxi-infections alimentaires liées à la consommation des œufs. Parmi les 91 protéines identifiées au total, 48 d’entre-elles présentent des orthologues dans le fluide amniotique humain. Certaines de ces protéines sont classées parmi les plus 95 abondantes dans le fluide amniotique pour les deux espèces (l’apolipoprotéine A1, l’ovotransferrine, l’albumine sérique, l’alpha-foeto protéine, la protéine qui lie la vitamine D), ce qui confirme que les fonctions principales du fluide, essentielles à la survie de l’embryon, sont conservées entre les espèces vivipares et ovipares (surtout dans les modèles étudiés ici, l’humain et la poule). Toutefois, le ratio et la composition en protéines associées dans la protection de l’embryon face aux pathogènes diffèrent selon le mode de reproduction. Le développement de l’embryon dans l’œuf, soumis aux pressions microbiennes de l’environnement, dont la flore bactérienne à la surface de la coquille, nécessite en effet l’implication de facteurs antibactériens recouvrant un large spectre d’action et spécifiques à l’oiseau, comme la bêta-défensine aviaire 11, l’ovalbumin-related protein X ou la bêta microséminoprotéine. Ces protéines constitueraient donc une adaptation du modèle de reproduction pour assurer le bon développement de l’embryon dans la coquille, malgré un environnement riche en pathogènes. Cette étude met en avant le rôle essentiel du fluide amniotique de l’œuf dans la protection de l’embryon face aux agressions physiques et microbiennes, particulièrement après le transfert du blanc dans le sac amniotique. Cette protection s’établit dans l’œuf, mais pourrait perdurer après l’éclosion sous la forme d’un biofilm protecteur déposé sur les plumes et la peau du poussin, ainsi que dans son tube digestif, après absorption orale. L’identification d’indicateurs (physicochimiques) et biomarqueurs moléculaires attestant du bon développement de l’embryon dans le fluide amniotique permettrait une meilleure compréhension de l’état de santé (stress, pathologie, etc.) de l’embryon et du futur poussin, pour garantir une meilleure gestion des risques de contamination et de mortalité en élevage, et surtout obtenir des meilleures performances chez le poussin et l’adulte.

EXPERIMENTAL PROCEDURES 

Samplings Fluids were sampled as previously described in Da Silva et al. (20). Briefly, fertile eggs were incubated under standard conditions (45% relative humidity, 37.8°C, automatic turning every hour), after a three-day storage at 16°C and 85% relative humidity to ensure synchronization of developmental stages (UE1295, INRA, F-37380 Nouzilly, France). At ED11 and ED16, 40 eggs of comparable weight (62.4 ± 4.3 g) containing viable embryos (checked by candling) were tested with the Acoustic Egg Tester (KU Leuven, Belgium), and cracked eggs were discarded. By ED11, egg white was sampled with a syringe after drilling a hole in the eggshell. After removing the eggshell, the egg content was further poured in a Petri dish and the AF was recovered with a syringe through the amniotic membrane. By ED16, the egg white was collected in the Petri dish with pliers due to its high viscosity. All samplings were performed under sterile conditions. Sex of individual embryos was determined using PCR (22).

 Fluid characterization

 After samplings, AF were centrifuged at 3,000 g (10 min, 4°C) to remove insoluble components. Volumes, pH (Microelectrode pH InLab 423, Fisher Scientific, Illkirch, France), osmolality (Fiske Mark 3 Osmometer, Advanced Instruments, Niederbronn Les Bains, France), and absorbance spectrum (Nanodrop, ND-100 Spectro, Wilmington, USA) were analyzed for each sample. The total protein concentration for each sample was assessed using BioRad DC Protein Assay Kit II (BioRad, Marnes-laCoquette, France). All samples (25 µL) containing loading buffer (0.25M Tris-HCl, 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol, 5% SDS, pH 6.8) were independently loaded on a 12.5% SDS-PAGE using a Mini-Protean II electrophoresis cell (BioRad, Marnes-laCoquette, France), and further stained by Coomassie Blue or silver nitrate. This overall characterization (pH, osmolality, protein concentration, absorbance and electrophoretic patterns, and embryo’s sex) helped us to select homogenous samples that were stored for further analyses by mass spectrometry.

In-Gel and in-Solution 

Digestion Twelves homogenous AF samples including six males and six females were pooled for protein identification. Proteins were either separated by a 4-20% SDS-PAGE followed by Coomassie Blue staining (in-gel analysis), or directly identified in solution (in-solution analysis) as described previously (20). SDSPAGE slices were rinsed separately in water and then acetonitrile. Protein were then reduced with dithiothreitol, alkylated with iodoacetamide, and incubated overnight at 37°C in 25mM NH4HCO3 with 12.5 ng/μL trypsin (Sequencing grade, Roche, Paris, France) as described by Shevchenko (23). Peptides were pooled and dried using a SPD1010 speedvac system. Peptide mixtures associated to each band and in-solution samples were analyzed using nano-LCMS/MS.

 Nano-LC-MS/MS 

 Resulting peptide mixture was analyzed using a LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer (Thermo Savant, Thermo Fisher Scientific) coupled to an Ultimate® 3000 RSLC chromatographer (Dionex, Amsterdam, The Netherlands) controlled by Chromeleon 6.8 software (Dionex, Amsterdam, The Netherlands). Five microliters of sample were desalted and pre-concentrated on an LCPackings trap column (Acclaim PepMap 100 C18, 100 μm inner diameter x 2 cm long, 3 μm particles, 100 Å pores) for 10 min at 5 μl/min with 4% solvent B (0.1% formic acid, 15.9% water, 84% acetonitrile) in solvent A (0.1% formic acid, 97.9% water, 2% acetonitrile). Separation was conducted using a LCPackings nano-column (Acclaim PepMap C18, 75 μm inner diameter × 50 cm long, 3 μm particles, 100 Å pores) at 300 nL/min by applying a gradient of 4 to 55% of solvent B during 90 min. Data were acquired using Xcalibur 2.1 software (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). The instrument was operated in positive mode in data-dependent mode. Survey full scan MS spectra (from 400 to 1800 m/z) were acquired with a resolution set at 60,000. The 20 most intense ions with charge states ≥ 2 were sequentially isolated (isolation width: 2 m/z; 1 microscan) and fragmented using Collision Induced Dissociation mode (energy of 35% and wideband-activation enabled). Dynamic exclusion was active during 30 s with a repeat count of one. Polydimethylcyclosiloxane (m/z, 445.1200025) ions were used for internal calibration.