Translocation d’acides nucléiques au travers d’un nanopore d’alpha hémolysine

Présentation des expériences de nanopore

Les nanopores, des compteurs Coulter à l’échelle moléculaire Un compteur Coulter est un appareil permettant de détecter électriquement le passage d’un objet à travers un trou de taille semblable à cet objet. La détection s’effectue via la mesure du courant électrique passant à travers ce trou. A potentiel constant, lorsqu’un objet passe à travers le trou, la résistance électrique du circuit augmente brutalement, le courant chute, signant ainsi le passage de l’objet.Bien que les dimensions soient extrêmement réduites, les expériences de nanopore suivent en grande partie ce principe. Un pore unique formé par une protéine, l’α-hémolysine, est inséré dans une bicouche lipidique, le tout baigné dans une solution saline concentrée (KCl à 1M). La membrane lipidique dans laquelle le pore est inséré est isolante électriquement. Une différence de potentiel électrostatique (100mV typiquement) est appliquée de part et d’autre de la membrane à l’aide d’électrodes d’argent, induisant un courant ionique de l’ordre de la centaine de picoampères. Par électrophorèse, les molécules chargées diffusant à proximité du pore, tels les acides nucléiques, sont entraînées à l’intérieur de celui-ci. Sur le schéma 2.1 on peut voir un duplex d’ADN (ADN double brin) se faire piéger dans le nanopore via une extrémité simple brin dépassant du double brin. Le courant électrique chute de manière concomitante à ce piégeage car la molécule d’ADN obstrue le pore. La différence de potentiel produit une force sur l’ADN, qui est une molécule chargée. Si la force électrostatique est suffisamment grande la molécule d’ADN est dénaturée et passe à travers le pore. Le courant électrique revient ensuite à son niveau initial. Typiquement, au cours d’une expérience, des centaines de signaux de translocations de molécules à travers le pore de ce type sont enregistrés puis analysés. En biologie, de tels compteurs sont utilisés en routine afin de dénombrer des cellules.

Les nanopores, des compteurs

Coulter à l’échelle moléculaire 9 ∆V≈100mV Phospholipid membrane ClK+ Time (ms) Current (pA) 100 50 10 Open pore current Time (ms) Current (pA) 100 50 10 Open pore current DNA duplex K+ ∆V≈100mV Time (ms) Current (pA) 100 50 10 ClK+ Blocked pore current ∆V≈100mV Time (ms) Current (pA) 100 50 10 ClK+ Open pore current Unzipping time ∆V≈100mV Figure 2.1 – Principe des expériences de nanopore. 10 Présentation des expériences de nanopore CIS TRANS .

Structure et propriétés de l’alpha hémolysine

Le nanopore d’alpha hémolysine (α-HL) a été le plus utilisé des nanopores dans les expériences de translocation de molécules uniques. C’est aussi celui que nous avons utilisé. Il s’agit d’une protéine de 293 acides aminés qui s’auto-assemble en heptamère dans les membranes cellulaires et synthétiques pour former un pore de 1.5nm de diamètre. In vivo α-HL est une toxine du Staphylocoque doré qui “perce” les globules rouges et les vide de leur contenu. La structure moléculaire de l’α-HL a été résolue par cristallographie aux rayons X [121]. La figure 2.2 montre sa structure typique en champignon. Le domaine transmembranaire est un canal composé de 14 brins en tonneau β ayant des résidus hydrophiles à l’intérieur du canal et hydrophobes à l’extérieur. Du compartiment cis (haut) vers le compartiment trans (bas), le canal est constitué d’une entrée de 2.6 nm de diamètre, d’un vestibule large de 4.6nm de diamètre, puis d’un resserrement d’1.5nm de diamètre suivi du domaine transmembranaire de 5nm de long et d’environ 2nm de diamètre. Deux anneaux de résidus chargés d’acides aminés sont présents, un chargé positivement à l’entrée du domaine transmembranaire, l’autre négativement à sa sortie. Le resserrement de 1.5nm permet à l’ADN simple brin de passer sans grande gêne stérique [59, 87], tandis que l’ADN double brin doit être dénaturé avant de pouvoir passer complètement à travers le pore.