Développement des méthodes : de la préparation de l’échantillon biologique l’analyse par spectrométrie de masse et l’interprétation des données

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ANALYSE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE

Précautions quant à l’utilisation du matériel : la chasse aux contaminants

Une attention particulière doit être portée sur la qualité des solvants, tampons utilisés, ainsi que sur la propreté de la verrerie. En effet, les solvants utilisés pour l’analyse des lipides (notamment le chloroforme et l’isopropanol) permettent une très bonne solubilisation de nombreux polluants comme les plastifiants par exemple (provenant autant de l’environnement du laboratoire que des instruments, chromatographe ou spectromètre de masse).

Ces contaminations ne sont pas à négliger puisqu’elles peuvent i) engendrer de mauvaises interprétations (la structure chimique de certains plastifiants pouvant être proche de celle des lipides) et ii) entraîner un phénomène de suppression de signal dû à une compétition à l’ionisation entre les contaminants et les lipides (phénomène fréquemment observable avec la source d’ionisation electrospray). Le recours à des blancs de solvant (contenant uniquement les solvants de reprise et ceux de dilution, notés S1 et S2, cf II.2.2), ainsi que des blancs d’extraction (extraction liquide-liquide sans échantillon, puis dilués dans S1/S2), permet d’identifier les contaminants liés aux processus d’extraction et au système analytique.

De plus, au vu des disparités de concentration des lipides (par exemple, PE 34:1 est approximativement 80 fois plus concentrée que CL 68 :34 ), la limite de solubilisation de certains lipides est rapidement atteinte lors de la concentration de l’échantillon. Ainsi, à part quelques lipides, l’échantillon est globalement peu concentré. Afin d’obtenir un bon signal sur bruit, Il convient de réduire au maximum les risques de contamination.

Pour cela, des protocoles très rigoureux de nettoyage de verrerie sont donc mis en place, ainsi que l’utilisation de solvants de qualité LCMS. Concernant la préparation des échantillons et des phases mobiles, les précautions suivantes doivent être appliquées :

4 Approximation à partir d’une acquisition : utilisation des masses dopées d’étalons internes PE 34 :0/ CL 56 :0 et

de la règle de proportionnalité ( 34:1 = × 34:0 68:3 = × 56:0 ).

34:134:068:356:0

P a g e 102 | 290

1) Eviter au maximum les plastiques : pesée du formiate d’ammonium à effectuer dans des béchers en verre, ne pas filtrer les phases mobiles (pour s’assurer de la bonne solubilisation du tampon, passer les phases mobiles au bain à ultrasons), ne pas pipeter le méthanol, le chloroforme et l’acide formique avec un cône en plastique, utiliser de l’acide formique dans un contenant en verre5,

2) Utiliser des solvants, du formiate d’ammonium et de l’acide formique, de grade LC-MS et ne jamais prélever directement dans les flacons,

3) Avant de préparer les phases mobiles, tester la qualité des solvants (surtout pour l’isopropanol) et des tampons (sources possibles de polyéthylène glycol) en ESI-MS (infusion),

4) Pour éviter les contaminations croisées, dédier des bouteilles pour la préparation des phases mobiles, spécifiquement pour les analyses des lipides,

5) Avant chaque utilisation, rincer les bouteilles avec quelques millilitres de solvants LC-MS, puis effectuer le même rinçage après utilisation et sécher à l’étuve.

Concernant l’utilisation du chromatographe et du spectromètre de masse :

1) Avant et après chaque analyse, nettoyer à l’éthanol la source d’ionisation, dans le cas d’une source avec le système Lockspray, démonter la pièce baffle pour la nettoyer et accéder au fond de la source (attention toutefois de ne pas toucher aux capillaires ESI et lockspray !),

2) Utiliser un cône dédié pour les analyses métabolomiques/lipidomiques,

3) Utiliser des solvants de rinçage des pistons et de l’aiguille contenant de l’isopropanol afin d’assurer le bon nettoyage du chromatographe,

4) Après équilibration de la colonne, faire l’acquisition de plusieurs blancs.

5 Si non disponible, vérifier la qualité du contenant en plastique, si celui-ci est devenu jaune pendant le stockage, la présence de Polyéthylène glycols peut être attendue.

Préparation des échantillons

Afin d’éviter l’oxydation des extraits lipidiques, ceux-ci doivent être séchés et conservés sous argon après chaque utilisation. Deux mélanges de solvants sont utilisés pour re-suspendre les extraits lipidiques pour l’analyse LC-MS (décrits par Paglia et al. [7]):

_le mélange de reprise S1 : chloroforme/méthanol (2/1), nécessaire pour la bonne solubilisation des lipides ;

_le mélange de dilution S2 : isopropanol/ acétonitrile/ eau (4/3/1), nécessaire pour éviter un phénomène de front diffus des pics chromatographiques (déformation des pics due à une force éluante du solvant de dilution trop élevée) et pour éviter la détérioration prématurée de la colonne (phase stationnaire sensible au méthanol et au chloroforme) ou du système chromatographique (mélange S1 très volatil : risque de précipitation de l’échantillon lors de l’injection).

Les extraits lipidiques de la souche P. aeruginosa PAK sont repris dans 50 µL de S1, alors que les extraits lipidiques des souches cliniques sont repris dans 30 µL de S1.6 Dix microlitres de ces solutions mères sont dilués au cinquième dans du S2 ; le restant est séché et conservé sous argon. Les échantillons peuvent éventuellement être stockés, après analyse, pendant un mois à -20°C, à condition de changer les bouchons dont le septum a été percé lors de l’analyse.

Préparation et suivi du bon déroulement d’une séquence métabolomique

Les analyses de type métabolomique impliquent l’acquisition d’un grand nombre d’échantillons afin d’obtenir une réponse à une question biologique. Puisque la variabilité instrumentale est bien plus faible que la variabilité biologique, il est plus pertinent d’utiliser des réplicats biologiques qu’analytiques.

6 Ces volumes ont été déterminés empiriquement, afin d’obtenir un bon rapport signal/bruit. Les variations de concentration entre les échantillons sont ensuite corrigées par l’utilisation des étalons internes.

De plus, réaliser des réplicats analytiques pour chaque réplicat biologique entraînerait des séquences d’acquisition très longues, allant de plusieurs jours à plusieurs semaines. Par conséquent, les séquences d’analyses métabolomiques consistent à privilégier l’utilisation d’un grand nombre d’échantillons biologiques pour chaque condition à comparer (ex : patients malades vs patients sains) plutôt que d’effectuer des réplicats analytiques. Cela implique i) d’obtenir des conditions analytiques robustes (absence de contamination croisée, stabilité des temps de rétention, limitation des pollutions extérieures, conditionnement de la colonne…), ii) de corriger la déviation analytique lors de la séquence, iii) de limiter les effets dus au hasard par une bonne aléatoirisation des échantillons, et iv) de disposer d’un nombre de réplicats biologiques suffisant pour pouvoir écarter ceux étant trop éloignés de la tendance générale, sans compromettre la validité du résultat.

Afin de répondre aux trois premières conditions, une première réflexion doit avoir lieu sur la liste de la séquence d’acquisition : quels sont les échantillons à analyser ? Peut-on les distinguer en groupes ? Peut-on utiliser des références pour corriger la déviation analytique ? Comment l’ordre d’injection peut-il impacter les résultats ?

Cette séquence d’acquisition est constituée telle qu’illustrée par le Tableau 1, à partir des recommandations de Broadhurst et al. [8]. La séquence illustrée ne contient qu’un lot d’analyses (batch). Ce lot a été répété deux fois afin d’obtenir les données LC-MS en mode positif et négatif. Des blancs solvants sont injectés afin de nettoyer la colonne et pour pouvoir déterminer le bruit de fond. Nous avons ensuite fait le choix d’injecter une gamme d’étalonnage externe afin de calculer les rendements d’extraction liquide-liquide. Des blancs extractions permettent de distinguer les contaminants des composés d’intérêt. Des contrôles qualités (QC pour quality control) sont dans un premier temps injectés pour équilibrer la colonne (répond à la problématique i), conditions analytiques robustes) et pour corriger la déviation analytique (répond la problématique ii), correction de la déviation analytique). Ces QC sont préparés en mélangeant 10 µL de chaque échantillon.

Table des matières

REMERCIEMENTS
ABREVIATIONS
CHAPITRE I Introduction
I.1 Pseudomonas aeruginosa
I.1.1 Caractéristiques de P. aeruginosa
I.1.2 Infections et résistance aux antibiotiques
I.1.1 Les traitements antibiotiques
I.1.2 L’enveloppe cellulaire de Pseudomonas aeruginosa
Références Chapitre I.1
I.2 Techniques d’analyse.
I.2.1 Sciences « omiques » et lipidomique
I.2.2 Analyse par UHPLC-IMS-MS
I.2.3 Outils de bioinformatique
Références Chapitre I.2
I.3 Problématique, objectif et plan
Références Chapitre I.3
CHAPITRE II Développement des méthodes : de la préparation de l’échantillon biologique
l’analyse par spectrométrie de masse et l’interprétation des données
II.1 Préparation de l’échantillon biologique
II.1.1 Souches bactériennes utilisées
II.1.2 Préparation des milieux SCFM et SCFM-PC
II.1.3 Culture bactérienne et obtention des culots bactériens
II.1.4 Lyse des alginates
II.1.5 Rupture des membranes et enrichissement en lipides membranaires
II.1.6 Extraction liquide-liquide
II.2 Analyse par spectrométrie de masse
II.2.1 Précautions quant à l’utilisation du matériel : la chasse aux contaminants
II.2.2 Préparation des échantillons
II.2.3 Préparation et suivi du bon déroulement d’une séquence métabolomique
II.2.4 Instrumentation
II.3 Traitement des données
II.3.1 Logiciels
II.3.2 Interprétation des données LC-MS
II.3.3 Calcul des sections efficaces de collision (CCS)
II.3.4 Traitement des données de type métabolomique
Références Chapitre II
CHAPITRE III Etude de la souche de référence P. aeruginosa PAK
III.1 Présentation et objectifs
III.2 Résultats
III.2.1 Etude structurale par mesure des CCS (1er article)
III.2.2 Etude de l’influence du milieu de culture (2nd article)
III.3 Conclusion
References Chapitre III (hors articles)
CHAPITRE IV Etudes de souches cliniques de Pseudomonas aeruginosa
IV.1 Présentation et objectifs
IV.2 Résultats
IV.2.1 Etude préliminaire et sélection des souches
IV.2.2 Etude des lipides membranaires extraits d’une souche de P. aeruginosa
d’un patient atteint d’une infection pulmonaire chronique (3ème article)
IV.3 Conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXES
VALORISATION DU TRAVAIL DE THESE