Activité antifalcémiante d’extraits de racines de Terminalia avicennioides

Activité antifalcémiante d’extraits de racines de Terminalia avicennioides

Diagnostic et dépistage de la drépanocytose (Couque et al, 2013)

Une anomalie de l’hémoglobine peut être recherchée devant des signes clinicobiologiques susmentionnés. Elle peut être demandée lors d’une enquête familiale ou du dépistage systématique chez une personne appartenant à une ethnie dite « à risque » ou encore dans un contexte anesthésique, anténatal, prégreffe etc. Enfin, il peut s’agir d’un test de confirmation d’un dépistage néonatal. 18 Le prélèvement de choix pour l’étude de l’hémoglobine est un échantillon sanguin recueilli sur EDTA. Le prélèvement doit être frais ou peut, à défaut, être conservé à +4 ° C pendant 1 semaine au maximum. ӀV.1-Techniques d’étude séparatives

Electrophorèse

L’électrophorèse sépare les hémoglobines en fonction de leur différence de charge dans un champ électrique.

Electrophorèse de zone à pH alcalin (pH = 8,6)

L’électrophorèse de zone à pH alcalin sur support solide (acétate de cellulose ou agarose) est encore une technique largement utilisée. Cinq grands groupes se distinguent en fonction de leur migration électrophorétique : A, N, J, S et C. Cette technique permet donc la séparation des principales hémoglobines : Hb A, Hb F, Hb S/D/G et Hb C/E/O-Arab (Figure 0:1). Elle est facile à mettre en œuvre, mais présente l’inconvénient de ne pas permettre une quantification fiable des fractions mineures et d’être peu résolutive.

Electrophorèse à pH acide (pH = 6)

L’électrophorèse à pH acide sur support solide (citrate agar ou agarose) est une technique de seconde intention. Son principal avantage est qu’en complément de l’électrophorèse à pH alcalin, elle peut séparer l’Hb S des mutants « S-like », et l’hémoglobine C (Hb C) de l’hémoglobine E (Hb E).

Isoélectrofocalisation (IEF)

L’IEF consiste à établir un gradient de pH de 5 à 8 grâce à des ampholines en gel d’agarose ou de polyacrylamide. Cette technique sensible et résolutive permet de séparer un grand nombre de fractions d’hémoglobines différentes en fonction de leur pI. Elle ne requiert, de plus, qu’une faible quantité de prélèvement, si bien qu’elle est très utilisée pour le dépistage néonatal de la drépanocytose. Cependant, cette technique a un coût relativement élevé, elle n’est pas quantitative, et nécessite une certaine expertise.

Electrophorèse capillaire (EC)

L’électrophorèse capillaire est une technique d’électrophorèse liquide plus récemment développée pour l’étude de l’hémoglobine. La détection s’effectue par spectrophotométrie à 415 nm (maximum d’absorption de l’oxyhémoglobine). Un électrophorégramme est alors généré avec les différentes fractions d’hémoglobines « normales » (Hb A, Hb F, Hb A2) et les fractions « anormales » de mutants caractérisés de façon présomptive en fonction de leur position relative dans des zones spécifiques : Hb S, Hb C, Hb E, Hb O-Arab, Hb D-Punjab etc. Une quantification relative des différentes fractions est réalisée. Cette technique présente l’avantage d’être automatisée, rapide, reproductible et quantitative, avec des tracés simples à interpréter.

Chromatographie

Chromatographie liquide haute performance (CLHP)

Cette méthode permet de séparer les différentes fractions d’hémoglobines en fonction de la force de leurs interactions ioniques sur une colonne échangeuse de cations (figure 0:1). Cette technique est automatisée, rapide, reproductible et quantitative. La validation des profils obtenus par CLHP repose sur un certain 20 nombre de critères. Il faut aussi s’assurer que la quantification des contrôles de qualité interne est correcte. Figure 11 : Exemples de profils en CLHP

Chromatographie liquide en phase inverse

Elle sépare les différentes chaînes de globine en fonction de leur hydrophobicité, permettant la séparation de variants ayant la même charge. Elle indique aussi la chaîne de globine qui est anormale. Cette technique est réservée à des laboratoires spécialisés

Spectrophotométrie de masse

Cette technique permet la séparation de différents fragments protéiques de masses différentes. La révélation d’une chaîne de globine avec une masse « anormale » et le calcul de la différence de masse permet d’en déduire l’acide aminé impliqué. Cette technique peut être couplée à des digestions enzymatiques préalables, qui permettent une précision plus importante.

Techniques d’étude non séparatives

Test de solubilité de l’Hb S : le test d’Itano

Le test d’Itano est effectué pour confirmer la présence d’Hb S et repose sur le principe que l’Hb S désoxygénée précipite en milieu réduit de phosphate concentré (2,24 M) (tube 2) : les barres derrières les tubes sont alors invisibles. Chez le sujet normal (tube 1), les barres derrières les tubes sont visibles 21 (figure 0:1). C’est une technique manuelle facile à mettre en œuvre et rapide (< 10 minutes). Son interprétation est facile à condition de prendre les précautions suivantes : – travailler toujours par comparaison avec un échantillon témoin AA négatif qui ne donne pas de précipité et un témoin positif AS de l’échantillon à analyser qui donne un précipité ; – dans chaque série : laver soigneusement le culot globulaire en sérum physiologique, afin d’éliminer tous les stromas cellulaires (risque de faux positifs) ; – savoir qu’un taux d’Hb S trop faible (< 20%) peut donner un résultat faussement négatif.

Test de falciformation d’Emmel

C’est également une technique manuelle qui met en évidence les drépanocytes sur lame lorsque le sang est mis en condition hypoxique en présence d’un réducteur (métabisulfite de sodium à 2%). Les hématies du drépanocytaire prennent alors une forme en « faucille » ou en « feuille de houx » (figure 13) tandis que les hématies du sujet sain gardent leur forme régulièrement arrondie. La lecture se fait au bout de 15 à 30 mn au microscope optique au grossissement 22 40. Elle nécessite plus de temps (45 minutes) et présente les mêmes risques de faux négatifs que le test d’Itano quand le taux d’Hb S est trop faible. Figure 13 : Test d’Emmel positif ӀV. 3-Place de la biologie moléculaire La caractérisation moléculaire est utile voire nécessaire pour le conseil génétique de couple à risque, pour affirmer ou simplement préciser le phénotype des cas index, de façon sporadique, pour caractériser des mutants. Le préalable à toute analyse génétique est l’obtention du consentement écrit du patient (ou de ses parents pour un mineur), de l’attestation de consentement dans le cas échéant. Les techniques utilisées sont des techniques de biologie moléculaire classiques : séquençage, dot-blot, gap-PCR, recherche de délétion par MLPA, etc. V-TRAITEMENT Le seul moyen de guérir la maladie est la greffe de moelle osseuse (ou de sang de cordon placentaire), qui reste réservée aux formes sévères et se limite principalement aux enfants qui ont un donneur intrafamilial compatible. Le traitement visera donc principalement la prévention, le traitement symptomatique et la prise en charge des complications (Choudja, 2012).

Prise en charge de la douleur

Pour cette maladie qui est marquée par le poids de la douleur, les techniques modernes du traitement antalgique ont eu un impact considérable sur la durée d’hospitalisation et sur la vie quotidienne des patients. Le recours à des 23 thérapeutiques orales : codéine, morphine orale, l’apport du MEOPA aux urgences, la nalorphine intrarectale, la pratique de l’administration contrôlée par voie IV de la morphine (PCA), ont largement contribué à l’amélioration des soins aux drépanocytaires. La lutte contre la douleur procède par étape des antalgiques de grade I aux morphiniques, en se basant sur une évaluation très rapprochée à l’aide d’échelles de la douleur adaptées à l’âge (échelle OPS, EVA par règle, etc.). La collaboration pour une unité spécialisée dans la prise en charge de la douleur est hautement souhaitable pour les crises sévères.

Organisation de la prévention de l’infection à pneumocoque

On a démontré que la pénicilline orale et les vaccinations régulières ont un rôle essentiel dans la protection contre l’infection foudroyante pneumococcique, si redoutable chez ces patients aspléniques qui décédaient naguère d’infection sévère dans les premières années de leur vie. Cet effet positif de la prévention par la pénicilline orale sur la mortalité des jeunes drépanocytaires a été démontré par Gaston et al (1986). Le nouveau vaccin pneumocoque conjugué heptavalent Prévenar® renforce cette prévention depuis sa mise sur le marché en 2001.

Accidents vasculaires cérébraux (AVC)

Ils méritent une place à part tant ils sont redoutés pour leur mortalité et pour leurs lourdes séquelles paralytiques et/ou psychiques. L’écho doppler transcrânien est devenu une pratique courante du bilan des enfants. Il permet de reconnaître à temps les malades menacés d’un AVC et de proposer des thérapeutiques et une surveillance spécifiques (Bégué, 2008). V.4-Crises de priapisme (Dupuy et al, 2004) Le priapisme aigu, souvent précédé d’épisodes de priapisme intermittent, est une urgence qui en l’absence de traitement évolue vers une fibrose définitive des corps caverneux. Le drainage sans lavage des corps caverneux avec injection de 10 mg d’étiléfrine doit être effectué en urgence. Devant une inefficacité de ce traitement ou devant un délai de plus de 5 heures de prise en charge du priapisme, un échange transfusionnel est nécessaire. Un traitement chirurgical doit être envisagé en cas d’échec de ces traitements. 24 V.5-Techniques médicales et chirurgicales modernes Elles ont permis aussi de grands progrès depuis vingt ans. Les progrès de l’anesthésie aux techniques mieux adaptées à ces malades à haut risque d’hypoxie permettent maintenant un recours plus aisé et plus fréquent aux interventions chirurgicales : cholécystectomie par laparoscopie ou par cœlioscopie, chirurgie précoce de la hanche, splénectomie, etc. L’utilisation du laser en ophtalmologie possible dès dix ans rend possible la prévention des lésions rétiniennes graves.

Progrès de la prise en charge thérapeutique

Mesures d’hygiène

Elles sont essentielles et reposent sur une meilleure connaissance de la physiopathologie. Elles sont à la source d’une amélioration importante de la vie des malades en évitant au maximum les causes d’hypoxie et la déshydratation, causes de la plupart des crises de falciformation. Des résultats significatifs sont obtenus grâce à des moyens simples tels que l’hydratation régulière et modulée sur l’effort, l’aménagement des efforts, la lutte contre l’hypoxie et contre le refroidissement, la prévention de la fièvre, tous moyens nécessitant l’éducation patiente des parents, des enfants ou des adultes malades.

Hydroxyurée (Hydréa ® )

L’hydroxyurée (Hydréa ® ) représente une étape et un tournant spectaculaire dans la prise en charge et la vie quotidienne de beaucoup de drépanocytaires. Elle nécessite des indications bien posées, une bonne compliance et une surveillance attentive de ses effets secondaires (Bégué, 2008). Cet effet bénéfique de l’Hydréa® avec une posologie de 20 à 25 mg/kg/j a été confirmé sans effets secondaires majeurs, ni toxicité hématologique sévère à 5 ans. Les mécanismes d’action de l’Hydréa® sont complexes. L’augmentation du taux d’Hb F initialement évoquée n’expliquait pas tout car la corrélation entre le taux d’Hb F et la diminution des crises vaso-occlusives n’a pu être mise clairement 25 en évidence. Des travaux récents ont montré que l’Hydréa® induisait la formation de NO in vivo (Dupuy et al, 2004)

Transfusion sanguine

Elle a été organisée, rationalisée, par des procédures précises. Le danger des transfusions massives ou répétées augmentant la viscosité sanguine et le risque de crises a été compris. Les transfusions d’échange se sont développées et la transfusion chronique est bien surveillée pour dépister et corriger ses complications. V.6.4-Vaccinations Elles se sont enrichies de vaccins importants pour cette maladie : vaccins Haemophilus influenzae b, pneumocoque, hépatite B, méningocoque conjugué C, grippe. V.6.5-Greffe médullaire allogénique Elle est réservée aux formes sévères et devrait s’étendre dans les années futures (Bégué, 2008). Il s’agit du seul traitement potentiellement curateur, permettant d’espérer le remplacement pour la vie de toutes les cellules hématopoïétiques par celles du donneur familial HLA identique de la fratrie AA ou AS. Le greffon peut être soit la moelle osseuse recueillie par ponction sous anesthésie générale ou le sang placentaire. Ce traitement lourd nécessite une hospitalisation de 6 semaines en moyenne en centre de greffe et un suivi étroit d’une année. Les résultats se sont considérablement améliorés au cours des dernières années avec, depuis 2000, un espoir de guérison de 95%. Les échecs sont liés au risque de rejet mais surtout à la GVH (réaction du greffon contre l’hôte) qui impose d’alourdir les traitements immunosuppresseurs exposant à un risque infectieux (Bernaudin, 2008).

Table des matières

PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES SUR LA DREPANOCYTOSE ET SUR Terminalia avicennioides
CHAPITRE I: LA DREPANOCYTOSE.
Ӏ-Généralités
Ӏ.1-Définition
Ӏ.2-Historique
Ӏ.3-Epidémiologie
Ӏ.4-Génétique et transmission de la drépanocytose
ӀӀ-Physiopathologie
ӀӀ.1- Rappels sur l’hémoglobine
ӀӀ.2- Pathogénie
ӀӀ.2.1-Au niveau moléculaire
ӀӀ.2.2-Au niveau cellulaire
ӀӀ.2.3-Au niveau rhéologique
ӀӀ.2.4-Au niveau vasculaire
ӀӀ.2.5-Au niveau immunologique
ӀӀӀ. Manifestations cliniques
ӀӀӀ.1-A partir du sixième mois
ӀӀӀ.2-De la cinquième année à l’adolescence
ӀӀӀ.3- A partir de la quinzième année
ӀV. Diagnostic et dépistage de la drépanocytose
ӀV.1-Techniques d’étude séparatives
ӀV.1.1-Electrophorèse
ӀV.1.1.1-Electrophorèse de zone à pH alcalin (pH = 8,6)
ӀV.1.1.2-Electrophorèse à pH acide (pH = 6) .
ӀV.1.1.3-Isoélectrofocalisation (IEF)
ӀV.1.1.4-Electrophorèse capillaire (EC)
ӀV.1.2-Chromatographie
ӀV.1.2.1-Chromatographie liquide haute performance (CLHP)
ӀV.1.2.2-Chromatographie liquide en phase inverse
ӀV.1.3-Spectrophotométrie de masse
ӀV.2-Techniques d’étude non séparatives
ӀV.2.1-Test de solubilité de l’Hb S : le test d’Itano
ӀV.2.2-Test de falciformation d’Emmel
ӀV. 3-Place de la biologie moléculaire
V-TRAITEMENT
V.1- Prise en charge de la douleur
V.2-Organisation de la prévention de l’infection à pneumocoque
V.3-Accidents vasculaires cérébraux (AVC)
V.4-Crises de priapisme
V.5-Techniques médicales et chirurgicales modernes
V.6-Progrès de la prise en charge thérapeutique
V.6.1-Mesures d’hygiène
V.6.2-Hydroxyurée (Hydréa ®)
V.6.3-Transfusion sanguine
V.6.4-Vaccinations
V.6.5-Greffe médullaire allogénique
V.7- Phytothérapie
V.7.1- Phytothérapie africaine
V.7.2- Voies de recherche en Phytothérapie
V.8- Voies de recherche en thérapeutiques pharmacologiques
CHAPITRE 2 : Terminalia avicennioides Guill. & Perr (Combretaceae)
I-Présentation botanique
I.1- Classification
I.1.1- Place systématique de l’espèce
I.2- Répartition géographique
I.3-Description botanique
I.3.1-Port
I.3.2-Feuilles
I.3.3-Fleurs
I.3.4-Fruits
II-Ecologie et méthodes de cultures
III-Utilisation thérapeutique traditionnelle de la plante
III.1-Feuilles
III.2-Fruits
III.3-Ecorce
III.4-Racines
IV-Chimie de Terminalia avicennioides Guill. & Perr
IV.1-Quelques groupes chimiques des plantes médicinales
IV.1.1-Tanins
IV.1.2-Flavonoïdes
IV.1.3-Alcaloïdes
IV.1.4-Hétérosides anthracéniques
IV.1.6-Hétérosides cardiotoniques
IV.2- Composition chimique de Terminalia avicennioides
V-Applications biologiques
V-1.Activité antioxydante
V-2.Activité antibactérienne
V-3. Activité antimycosique
V-4.Effets antihelminthiques
V-5.Effet antitrypanosomique
V-6.Effet antipaludique
V-7.Effet gastroprotecteur
V.8-Activité cicatrisante
V.9-Toxicité
VI. Terminalia avicennioides : un candidat potentiel pour l’industrie pharmaceutique
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I- Cadre de l’étude
II-Matériel et méthodes
II.1-Matériel de laboratoires
II.1.1-Matériel d’extraction
II.1.2-Matériel de screening phytochimique
II.1.3-Matériel d’électrophorèse
II.1.4-Matériel de l’étude des propriétés antidrépanocytaires
II.2-Matériel végétal
II.3-Matériel biologique
II.4-Préparation des extraits
II.4.1-Découpage et broyage des racines
II.4.2-Distillation des solvants d’extraction
II.4.3-Extraction solide-liquide: la macération
II.4.3.1-Macération
II.4.3.2-Filtration au Büchner
II.4.3.3-Séchage par l’évaporateur rotatif: rotavapor
II.4.3.4-Détermination du rendement
II.4.4-Extraction liquide-liquide: fractionnement
II.4.4.1-Préparation de la phase aqueuse
II.4.4.2-Fractionnement
II.5-Screening phytochimique
II.5.1-Groupes chimiques étudiés
II.5.2-Méthodes de caractérisation
II.5.2.1-Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
II.5.2.2-Détermination du pouvoir moussant
II.5.2.3-Colorimétrie
II.6- Etude de l’activité antifalcémiante des extraits organiques de racines de Terminalia avicennioides
II.6.1-Détermination des profils drépanocytaires
II.6.1.1-Etapes pré-analytiques
II.6.1.2-Etape analytique
II.6.2-Recherche de l’activité antifalcémiante in vitro sur sang drépanocytaire SS et sur sang drépanocytaire AS
II.6.2.1-Préparation des solutions d’extraits organiques de racines de Terminalia avicennioides
II.6.2.2-Recherche in vitro de l’activité antifalcémiante
III-Résultats
III.1-Extractions
III.2-Screening phytochimique
III.2.1-CCM
III.2.2-Pouvoir moussant .
III.2.3-Colorimétrie
III.3-Profils électrophorétiques
III.4- Activités antifalcémiantes
III.4.1-Effets des extraits organiques sur les hématies SS
III.4.2-Effets des extraits organiques sur les hématies AS
IV. DISCUSSION

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