Application de l’analyse métabolomique à la détection ciblée et globale de contaminants organiques

Application de l’analyse métabolomique à la détection ciblée et globale de contaminants organiques

Définition d’un polluant

Selon le dictionnaire du vocabulaire normalisé de l’Environnement de l’AFNOR [1], un polluant est un altéragène biologique, physique ou chimique qui provoque des impacts négatifs sur tout ou partie d’un écosystème (air, eau, sol), de l’environnement en général et/ou d’un organisme (qui peut être l’Homme). Au sens large, le terme désigne des agents qui sont à l’origine d’une altération des qualités du milieu, même s’ils y sont présents à des niveaux inférieurs au seuil de nocivité. Pour les polluants qui ont un effet nocif sur les organismes vivants, on réserve le terme de contaminants. On peut désigner sous le terme de polluant toute substance artificielle produite par l’homme et dispersée dans l’environnement, mais aussi toute modification d’origine anthropogène affectant le taux et/ou les critères de répartition dans la biosphère d’une substance naturelle propre à tel ou tel milieu. L’emploi du mot « xénobiotique » est également très courant. Il désigne toutes les substances présentes dans un organisme vivant mais qui lui sont étrangères (d’après le centre national de ressources textuelles et lexicales [2]).

Les différents types de polluants chimiques organiques

Dans ce mémoire, nous nous intéresserons uniquement aux contaminants organiques, c’està-dire aux molécules composées d’une structure carbonée, par opposition aux contaminants inorganiques qui n’en contiennent pas. Ces molécules constituent en effet une part quasiexclusive des composés produits par l’activité humaine. On distingue 3 grands types de contaminations organiques : les biocides, les médicaments et la pollution domestique et industrielle.

Les biocides

Le mot biocide (étymologiquement : bio + cide = « qui tue la vie ») désigne une large famille de substances destinés à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir l’action ou à les combattre, par une action chimique ou biologique. Bien que ciblant les organismes nuisibles, les biocides sont par définition des produits actifs susceptibles d’avoir des effets sur l’homme, l’animal ou l’environnement [3]. Ces produits 4 sont classés en quatre grands groupes : (i) les désinfectants (ex : décontamination des mains et de l’eau), (ii) les produits de protection (ex : produits de protection du bois contre les insectes ou les champignons), (iii) les produits de lutte contre les nuisibles (ex : rodenticide, insecticide) et (iv) les autres produits (ex : peintures anti-salissures appliquées sur les bateaux). Dans la famille des biocides, une grande majorité est plus communément appelée pesticides (étymologiquement : pest + cide = « qui tue les nuisibles »). Elle regroupe non seulement les substances « phytosanitaires » (également appelées « phytopharmaceutiques », produits utilisés pour traiter les plantes), mais aussi les produits zoosanitaires (produits utilisés pour traiter les animaux), les produits de traitements conservateurs du bois, et de nombreux produits d’usage domestique : shampoing anti-poux, boules antimites, poudres antifourmis, bombes insecticides contre les mouches, mites ou moustiques, colliers antipuces, diffuseurs intérieurs de pesticides, etc. [4] (Figure 1). Figure 1 : Classification des produits phytosanitaires, pesticides et biocides (Adapté du travail de Lamiot [5]) Les pesticides regroupent plusieurs sous-catégories : • Les acaricides, utilisés pour tuer les acariens ; • Les algicides, utilisés pour tuer les algues ou lutter contre leur développement ; • Les avicides, utilisés pour tuer les oiseaux ; • Les bactéricides, utilisés pour tuer les bactéries ; • Les fongicides, utilisés pour tuer les champignons ou inhiber leur croissance ; • Les herbicides, (appelés désherbants, phytocides ou débroussaillants) utilisés pour détruire les adventices (« mauvaises herbes ») ; • Les insecticides, utilisés pour détruire les insectes ou prévenir leur développement ; • Les molluscicides, utilisés pour tuer les limaces et les escargots ; • Les nématicides, utilisés pour tuer les nématodes ; • Les parasiticides, utilisés pour tuer les parasites ; 5 • Les rodenticides, utilisés pour tuer les rongeurs ; • Les taupicides, utilisés pour tuer les taupes ; • Les régulateurs de croissance, utilisés pour la prévention de la croissance excessive d’une plante favorisant la résistance des plantes, le bouturage, la mise en fruit. Chacune de ces sous catégories est généralement à nouveau subdivisée en sous classe en fonction des modes d’épandages, d’adsorption (par la plante ou l’animal) et/ou du mode d’action de la molécule (ce qui correspond généralement à une famille chimique). Pour exemple, les substances utilisées dans la seule famille des herbicides sont d’environ 700 molécules réparties en 42 familles chimiques [6]. Le nombre de pesticides susceptibles de se retrouver dans l’environnement est par conséquent très important. Par ailleurs, leur utilisation est intensive. Ainsi, 1000 euros de pesticides sont consommés chaque seconde dans le monde pour atteindre 30 milliards d’euros chaque année. La France est d’ailleurs le premier consommateur européen de pesticides devant l’Allemagne avec 35 % de ces terres soumises à des traitements, ce qui représente 2 milliards de dépenses en produits phytosanitaires par an

Les médicaments

Les médicaments sont principalement d’origine organique. Il s’agit de toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l’égard des maladies humaines ou animales, ainsi que toute substance ou composition pouvant être utilisée chez l’homme ou chez l’animal ou pouvant leur être administrée, en vue d’établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique ou métabolique [8]. Au même titre que les pesticides, la classification générale des médicaments est très vaste et généralement organisée selon l’indication pharmacothérapeutique des molécules (Dorosz 2009 [9]). Dans cette classification présentée en annexe 1 sont consignées les 25 grandes classes pharmacothérapeutiques. Ces différentes classes de médicaments regroupent en France environ 3000 substances actives soit environ 12 000 représentations pour un montant annuel de vente d’environ 27 milliards d’euros [10]. La France est le 5ème consommateur mondial de médicaments avec 4,4 % de parts de marché [11]. Ces larges quantités vendues et consommées sont autant de source de pollution de notre environnement.

Les pollutions industrielles et domestiques

Les pollutions industrielles et domestiques désignent les formes de pollution directement induites par l’industrie et la consommation domestique. La pollution industrielle est soit aiguë et accidentelle, soit « diffuse » et chronique. Elle concerne toute la filière industrielle : du processus en amont (mines, carrières, transport ou préparation de ressources), en passant par l’industrialisation et les déchets et/ou sous-produits de fabrication qu’elle génère jusqu’à la fin de vie des machines et des usines. Il existe plusieurs catégories de polluants chimiques industriels ou domestiques :

Les hydrocarbures liquides

Pétrole et dérivés, principalement des alcanes, sont rejetés notamment à la mer. Leur origine est liée à l’industrie et l’urbanisation continentale [12]. Pour exemple, les très médiatiques marées noires de l’Erika ou du Prestige ne représentent que 6 % de la contribution à la pollution aux hydrocarbures en mer.

Les produits de combustions industrielles et domestiques

Ils proviennent de la combustion incomplète de matières fossiles (charbon, fioul, essence) ou de l’utilisation de solvants (peintures, colles). Ils forment des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) et des Composés Organiques Volatils (COV) qui sont rejetés dans l’atmosphère. Par ailleurs, l’activité de l’industrie métallurgique et sidérurgique forme des dioxines, substances extrêmement toxiques pour l’environnement et pour l’Homme.

Les tensioactifs

Ils sont très utilisés dans l’industrie (notamment du textile et de la métallurgie) et la consommation domestique (lessive, produits d’entretiens, shampooings, produits cosmétiques, etc.) comme détergents, agents de solubilisation, agents moussants, mouillants, dispersants ou émulsifiants [13]. On distingue 4 types de composés tensioactifs : Les tensioactifs anioniques : savons alcalins, savons métalliques, savons organiques, dérivés sulfatés (exemple : laurylsulfate de sodium), très utilisés comme agents émulsionnants ou moussants, et sulfonés (exemple : dioctylsufosuccinate de sodium) souvent caractérisés par un fort pouvoir mouillant. 7 Les tensioactifs cationiques : sels d’ammonium quaternaire (exemple : chlorure de benzalkonium) ayant des propriétés bactériostatiques et émulsionnantes. Les tensioactifs zwitterioniques ou amphotères : les bétaïnes utilisés comme agents moussants et détergents, les dérivés imidazolines utilisés comme agents moussants et antiseptiques. Les tensioactifs non ioniques : sous forme d’ester (exemple : ester de glycol, esters de sorbitane), sous forme d’éther (exemple : éther de polyéthylèneglycol), sous forme de liaison amide (exemple : acide gras monoethanolamide de noix de coco) utilisés pour ses propriétés moussantes, émulsionnantes, détergentes et épaississantes.

Table des matières

REMERCIEMENTS
PREAMBULE
SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES, TABLES ET EQUATIONS
LISTE DES ABREVIATIONS ET ACRONYMES
CHAPITRE I. PROBLEMATIQUE ET ETAT DE L’ART
I. LA POLLUTION : DEFINITION, CLASSIFICATION ET ORIGINE. 3
I.1. Définition et classification des polluants
I.1.1. Définition d’un polluant
I.1.2. Les différents types de polluants chimiques organiques
I.2. Origine des polluants dans l’environnement et voies d’exposition .8
I.2.1. La production (activité industrielle)
I.2.2. L’utilisation
II. LA POLLUTION : CONSEQUENCES CONNUES ET MOYENS D’ENCADREMENT
II.1. Conséquences connues sur la biodiversité environnementale 19
II.1.1. Généralités
II.1.2. Impact des pesticides
II.1.3. Impact des médicaments
II.2. Conséquences connues sur l’Homme
II.2.1. Effets des pesticides sur l’Homme
II.2.2. Effets des résidus médicamenteux sur l’homme
II.3. Réglementation
II.3.1. Au niveau mondial
II.3.2. Au niveau européen et national
III. LA POLLUTION : COMMENT LA DETECTER ?
III.1. Historique
III.2. Les moyens de détection : classification et utilisation
III.2.1. Techniques de détection sans couplage préalable
III.2.2. Techniques de détection avec couplage chromatographique 54
III.3. La spectrométrie de masse
III.3.1. Principe général
III.3.2. Les sources d’ionisation
III.3.3. Les analyseurs
III.4. Le système introductif
III.4.1. Introduction directe en spectrométrie de masse
III.4.2. Couplage de la chromatographie et de la spectrométrie de masse
III.5. Préparation d’échantillon
III.5.1. La préparation d’échantillon liquide
III.5.2. La préparation d’échantillon solide
III.5.3. La préparation d’échantillon de type QuEChERS
IV. APPORT DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION ET DE L’ANALYSE
METABOLOMIQUE A L’ANALYSE DE POLLUANTS DANS LES MATRICES AGROALIMENTAIRES
ET ENVIRONNEMENTALES
IV.1. Introduction
IV.2. Le problème des métabolites
IV.3. Apport de la spectrométrie de masse à haute résolution pour la recherche de composés
innatendus ou inconnus
IV.4. La métabolomique
IV.4.1. Principe général
IV.4.2. Le traitement des données
IV.4.3. La normalisation
IV.4.4. Les analyses statistiques
IV.4.5. L’annotation
V. OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE
CHAPITRE II. UTILISATION DE L’ANALYSE METABOLOMIQUE
POUR LA DETECTION DE POLLUANTS : EXPERIENCES DE
PREUVE DE CONCEPT
I. INTRODUCTION105
II. LE MIEL : PREMIERE PREUVE DE CONCEPT
II.1. Introduction
II.2. Matériel et Méthodes
II.2.1. Produits chimiques et réactifs
II.2.2. Préparation des solutions de travail
II.2.3. Echantillons de miels
II.2.4. Préparation des échantillons
II.2.5. Analyses par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
II.3. Traitement des données
II.3.1. Traitement de données pour l’analyse ciblée
II.3.2. Traitement de données pour l’analyse non ciblée
II.3.3. Identification des xénobiotiques chlorés dans les échantillons de miel
II.3.4. Analyses statistiques
II.4. Résultats et discussion
II.4.1. Détection de polluants par approche ciblée dans le miel
II.4.2. Analyses globales réalisées à partir des empreintes LC-HRMS
II.5. Conclusion
III. L’ANALYSE DE L’EAU ISSUE DE PUITS DE CAPTAGE : DEUXIEME PREUVE DE CONCEPT
III.1. Introduction
III.2. Matériel et Méthodes
III.2.1. Produits chimiques et réactifs
III.2.2. Préparation des solutions de travail
III.2.3. Sélection et prélèvement de l’eau issue des puits de captage
III.2.4. Préparation des échantillons
III.2.5. Analyses par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
III.2.6. Traitement des données
III.3. Résultats et discussion
III.3.1. Détection des polluants dans les puits de captage
III.3.2. Comparaison entre l’analyse métabolomique et les analyses conventionnelles
III.3.3. Analyses statistiques univariées
III.3.4. Analyse en composantes principales
III.4. Conclusion
IV. BILAN DES ETUDES DE PREUVE DE CONCEPT
CHAPITRE III. DEVELOPPEMENT D’UNE ANALYSE CIBLEE A
LARGE SPECTRE DANS L’EAU
I. INTRODUCTION
I.1. Contexte
I.2. Objectifs du projet Agrifood GPS
I.3. Organisation du projet
I.4. Etat de l’art
I.5. Objectifs du développement
II. MATERIEL ET METHODES
II.1.1. Produits chimiques et réactifs
II.1.2. Préparation des solutions de travail
II.1.3. Les échantillons d’eau
II.1.4. Préparation des échantillons
II.1.5. Analyses par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
II.2. Traitement des données
II.2.1. Traitement des fichiers FIA et recherche des temps de rétention
II.2.2. Optimisation chromatographique
II.2.3. Outils et critères d’identification pour l’analyse ciblée
III. RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. Constitution de la base de donnée
III.1.1. Choix des polluants
III.1.2. Réalisation des solutions de travail
III.1.3. Caractérisation MS
III.1.4. Réalisation d’une banque de données MS/MS
III.2. Optimisation des conditions d’analyse SPE en ligne et d’UHPLC
III.2.1. Optimisation de la chromatographie liquide
III.2.2. Optimisation de la préconcentration en ligne
III.2.3. Validation des recherches effectuées avec l’outil MethodComparator et confirmation des temps de
rétention sur le système analytique HSS T3 – pH 2,5
III.3. Validation
III.3.1. Etude de la spécificité de la méthode analytique développée
III.3.2. Fidélité inter- et intra-jour
III.3.3. Linéarité et limites de détection (LOD)
III.3.4. Etude du facteur de concentration de l’étape SPE
III.3.5. Effet matrice sur 3 concentrations
III.3.6. Effet mémoire et plan d’expérience
III.3.7. Bilan de la validation
III.4. Application de la méthode
III.4.1. Méthodologie
III.4.2. Résultats
III.5. Conclusion
CHAPITRE IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
I. ANNEXE 1 : CLASSIFICATION DES MEDICAMENTS
II. ANNEXE 2 : SPECTROMETRIE DE MASSE RAPPEL THEORIQUES
III. ANNEXE 3 : RAPPELS THEORIQUES SUR LA CHROMATOGRAPHIE
IV. ANNEXE 4 : LES TECHNIQUES DE PREPARATION D’ECHANTILLON
V. ANNEXE 5 : PRINCIPE GENERAL DU FONCTIONNEMENT DU LOGICIEL XCMS
VI. ANNEXE 6 : TABLEAU DES 817 MOLECULES SELECTIONNEES DANS LE CADRE DE LA
COLLECTE 1 DU PROJET AGRIFOOD
PRODUCTION SCIENTIFIQUE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
PUBLICATIONS