Caractérisation d’un explant de peau humaine par microscopie 3D et application à la dermo-cosmétique

Caractérisation d’un explant de peau humaine par
microscopie 3D et application à la dermo-cosmétique

La peau humaine

La peau est l’organe les plus lourds du corps humain, soit 15% du poids total d’un adulte. La peau est constituée de l’hypoderme, du derme et de l’épiderme à sa surface (Figure 1). Ces différentes strates de cellules sont complétées par un système sensoriel, vasculaire et d’annexes cutanées liées à la pilosité de la peau. Sa structure complexe lui permet de remplir de multiples fonctions telles que la thermorégulation, le maintien de l’hydratation du corps, la propriété sensorielle et la protection de l’organisme contre l’environnement extérieur.

La structure générale

Les annexes cutanées

Les annexes regroupent les glandes cutanées et les phanères (poil et ongles). Les glandes cutanées regroupent les glandes sébacées et les glandes sudoripares apocrines et eccrines. Elles sont insérées dans le derme.

Le follicule pileux

Le follicule pileux est composé du poil, de sa gaine épithéliale et du muscle arrecteur. Nous retrouvons à la base du poil une cavité avec un tissu conjonctif très vascularisé, la papille folliculaire intégrée au sein du bulbe pileux. Il est constitué de cellules matricielles qui vont proliférer et progresser vers la surface de la peau pour donner les kératinocytes de la tige pilaire et la gaine épithéliale interne. Il y a également la gaine externe (infundibulum) qui dérive d’une invagination tubulaire de l’épiderme et qui s’étend profondément dans le derme (Figure 2). Le muscle arrecteur du poil est un muscle lisse qui est oblique. Sa partie inférieure s’insère sur la lame basale du follicule et sa partie supérieure sur la jonction dermo-épidermique. La contraction de ce muscle provoque la verticalisation du poil, connu sous le nom d’horripilation. Sous ce muscle nous trouvons une zone primordiale du poil, le bulge, où les cellules souches du poil sont stockées. La gaine du poil est reliée aux glandes sébacées et aux glandes sudoripares apocrines (Shimomura and Christiano, 2010).

Les glandes sébacées

Les glandes sébacées sont le plus souvent annexées au poil. Les cellules qui constituent la partie sécrétrice sont appelées sébocytes. Ils se différencient de la périphérie de la glande vers son centre, se chargent alors progressivement de lipides et augmentent en volume. Le noyau devient pycnotique (condensation de la chromatine), la cellule est éliminée en totalité avec son produit de sécrétion. Le sébum riche en lipides (cholestérol, triglycérides, acides gras) va alors être sécrété vers la surface de l’épiderme pour former un film de protection contre le dessèchement de la peau et les infections bactériennes. La sécrétion est contrôlée par les hormones sexuelles (Mauro, 2008).

Les glandes sudoripares apocrines

Les glandes sudoripares apocrines sont annexées à la gaine du follicule pileux. Elles sont principalement situées dans la région axillaire et pubienne. Elles produisent et excrètent un soluté riche en protéines. Elles interviennent dans la thermorégulation du corps.

Les glandes sudoripares eccrines

Les glandes sudoripares eccrines sont réparties sur toute la surface de la peau et impliquées dans la régulation de la température. Chez l’homme, nous en comptons entre 2 à 5 millions (Cui and Schlessinger, 2015; Gray, 1918). Elles sont composées de cellules glandulaires cylindriques formant un conduit permettant d’excréter principalement de l’eau, des minéraux, du lactate et de l’urée. La portion sécrétrice se situe dans la partie profonde du derme alors que la partie excrétrice chemine dans le derme puis l’épiderme perpendiculairement à la surface de la peau et se termine par un pore (Kolarsick et al., 2011a)

Table des matières

Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I. La peau humaine
I.1 La structure générale
I.1.1 Les annexes cutanées
I.1.1.1 Le follicule pileux
I.1.1.2 Les glandes sébacée
I.1.1.3 Les glandes sudoripares apocrines
I.1.1.4 Les glandes sudoripares eccrines
I.1.2 L’hypoderme
I.1.3 Le derme
I.1.4 La jonction dermo-épidermique
I.1.5 L’épiderme
I.1.5.1 La couche basale
I.1.5.2 La couche épineuse
I.1.5.3 La couche granuleuse
I.1.5.4 La couche cornée
I.2 Les fonctions physiologiques de la peau
I.2.1 La gestion de l’hydratation
I.2.2 La régulation thermique
I.2.3 Un organe sensoriel
I.2.4 La résistance aux chocs physiques
I.2.5 Une barrière protectrice
CHAPITRE II. Le vieillissement cutané
II.1 Les différents types de vieillissement cutané
II.1.1 Le vieillissement chronologique
II.1.2 Le vieillissement extrinsèque
II.1.2.1 L’intoxication tabagique
II.1.2.2 La pollution
II.1.2.3 L’exposition aux UV et photovieillissement
II.2 Les effets biochimiques et tissulaires
II.2.1 Les effets communs du vieillissement cutané
II.2.1.1 L’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène
II.2.1.2 Les altérations de l’ADN
II.2.1.3 La glycosylation spontanée, non enzymatique des protéines
II.2.1.4 L’oxydation des protéines
II.2.1.5 La dégradations des fibres dermiques
II.2.1.6 La lipoperoxydation
II.2.2 Les altérations spécifiques du vieillissement chronologique
II.2.3 Les altérations spécifiques du vieillissement extrinsèque
II.2.3.1 Les effets du tabac
II.2.3.2 Les effets de la pollution
II.2.3.3 Les effets des UV
II.2.3.3.1 La création de photoproduits et d’altération de l’ADN
II.2.3.3.2 Les altérations des kératinocytes
II.2.3.3.3 La dégradation de la matrice extracellulaire
II.3 Les systèmes de défenses endogènes
II.3.1 Les molécules antioxydantes
II.3.2 Le piégeage des ions métalliques
II.3.3 La réparation de l’ADN
II.3.4 La sénescence et la mort cellulaire
II.3.5 Systèmes de défense endogène contre les UV : La mélanogénèse
II.4 Les traitements préventifs et curatifs
II.4.1 Les traitements spécifiques du vieillissement chronologique
II.4.1.1 Traitement préventif : L’hygiène de vie
II.4.1.2 Les traitements curatifs anti-âge et oestrogénothérapie
II.4.1.3 Les traitements chirurgicaux
II.4.2 Les traitements spécifiques du vieillissement extrinsèque
II.4.3 Les traitements spécifiques du photovieillissement
II.4.3.1 Hygiène et mode de vie : la prévention
II.4.3.2 Les produits solaires
II.5 Les maladies liées au vieillissement prématuré
II.6 L’épidémiologie du vieillissement cutané
CHAPITRE III. L’absorption cutanée
III.1 Introduction et définitions
III.2 Les différentes voies de pénétration
III.3 Les facteurs influençant l’absorption cutanée
III.4 L’évaluation de la pénétration d’un composé
III.4.1 La cellule de diffusion
III.4.2 L’imagerie
III.4.3 La technique du tape-stripping
CHAPITRE IV. Les techniques d’études de la peau
IV.1 Les modèles biologiques cutanés
IV.1.1 Les modèles cutanés in vivo
IV.1.1.1 Le modèle animal
IV.1.1.2 Les études cliniques sur volontaires
IV.1.2 Les modèles cutanés in vitro
IV.1.2.1 La culture cellulaire en monocouche
IV.1.2.2 Les substituts de peaux
IV.1.3 Les modèles cutanés ex vivo : l’explant de peau
IV.1.4 Le choix du modèle cutané
IV.2 L’imagerie
IV.2.1 L’imagerie en 2D de la peau
IV.2.1.1 La préparation de l’échantillon
IV.2.1.2 La microscopie optique champ large
IV.2.1.3 La microscopie électronique à transmission
IV.2.2 L’imagerie en 3D de la peau
IV.2.2.1 La préparation de l’échantillon
IV.2.2.1.1 La transparisation
IV.2.2.1.2 L’autofluorescence et marquage spécifique
IV.2.2.2 La Tomographie à Cohérence Optique
IV.2.2.3 La microscopie confocal
IV.2.2.4 La microscopie biphotonique
IV.2.2.5 La microscopie à feuille de lumière
OBJECTIFS DE LA THESE
PARTIE 1 – Caractérisation d’un explant de peau humaine par microscopie 3D
I. Observation de peaux saines et pathologiques par LSFM
II. Article I : 3D Imaging of Cleared Human Skin Biopsies Using Light-Sheet
III. Résultats complémentaires : Observation des altérations de la peau induites par un stress extérieur
III.1 Dommages causés par une brûlure
III.2 Détérioration de la peau par un détergent
III.3 Effet d’une irradiation UVB et UVA sur explant de peau
IV. Conclusion et discussion partie 1
➢ Est-il possible d’observer un explant de peau en 3D et en profondeur
grâce à la méthodologie développée ?
➢ Cette méthodologie est-elle adaptée pour évaluer les effetsdes agressions extérieures ?
PARTIE 2 – Caractérisation et protection des effets des UVA sur un modèle de peau ex-vivo
I. Détermination de la dose d’irradiation du modèle « explant UVA »
II. Etude des effets des UVA et de sa protection sur explant de peau 2
III. Article 2 : A skin explant model to evaluate protective effect of dermo-cosmetic compounds against uva damage 3
IV. Résultats complémentaires
IV.1 Etude de l’épiderme
IV.1.1 Analyse de l’épaisseur de l’épiderme
IV.1.2 Observation de protéines de la différenciation
épidermique
IV.2 Analyse du Derme
IV.2.1 Observation de la structure du derme
IV.2.1.1 Analyse par microscopie champ large
IV.2.1.2 Analyse par microscopie biphotonique
IV.2.1.3 Analyse ultrastructurale
IV.2.2 Analyse de l’activité enzymatique des protéases
du derme
V. Conclusion et discussion partie 2
➢ Les caractéristiques du modèle « explant UVA » sont-elles Comparables au photovieillissement in vivo ?
➢ Quels sont les avantages et les inconvénients du modèle cutané d’explant de peau humaine ?
➢ Le modèle est-il adapté pour cribler l’effet de nouvelles molécules ?
➢ Quel est l’apport de la microscopie 3D dans l’analyse ?
➢ Quelles sont les perspectives d’utilisation de cette méthodologie ?
PERSPECTIVES GENERALES
MATERIELS ET METHODES
I. Explant de peau humaine
II. Dommages extérieurs appliqués sur les explants
II.1 Brulure à l’eau chaude
II.2 Exposition au SDS
II.3 Exposition unique aux UVA
II.4 Exposition unique aux UVB
II.5 Irradiation répétée aux UVA
II.6 Exposition aux ROS par réaction enzymatique
III. Traitements
III.1 Traitement par la protection solaire
III.2 Traitement par les molécules de la société Syntivia
III.3 Mesure de l’absorbance des molécules
IV. Méthode de transparisation et imagerie 3D
IV.1 Coloration avant transparisation
IV.2 Transparisation
IV.3 Immunomarquage 3D
IV.4 Microscopie à feuille de lumière (LSFM)
IV.5 Analyse de l’épiderme et du derme par microscopie confocale et biphotonique
IV.6 Analyse d’image en 3D
IV.7 Réversion de la transparisation
V. Méthode sur coupe de paraffine
V.1 Inclusion en paraffine
V.2 Coloration histologique
V.3 Immunomarquage 2D
V.4 Essai Tunel
VI. Méthode sur cryocoupe : Zymographie in situ
VII. Microscopie électronique à transmission
VIII. Analyses statistiques
REFERENCES