ÉTUDE DE L’ACTIVITÉ ANTIDIARRHÉIQUE DE L’EXTRAIT RAN 02 CHEZ LE COCHON D’INDE

PARTIE CHIMIQUE 

Préparation de l’extrait

Les feuilles de la plante de grenadine ont été récoltées dans la région d’Analamanga au mois de novembre 2016. Elles ont été séchées à l’ombre, à la température ambiante, pendant 20 jours. Ensuite 200 g de la matière végétale sèche ont été broyés à l’aide d’un broyeur à marteau (BROOK CROMPTON©, série 2000) au Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie (LPGPC), à la Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo. La poudre obtenue a été macérée dans un mélange éthanol – eau (60 : 40), à la température ambiante pendant 4jours. Le macérât a été filtré sur du coton hydrophile, et le filtrat récupéré a été évaporé à l’aide d’un distillateur (Figure 1) à la température de 80°C, puis dans un bain marie, à la température de 100°C jusqu’à l’évaporation totale du solvant (Figure 2). L’extrait sec ainsi obtenu a été codé RAN02 et pesé pour calculer le rendement. Le rendement de l’extraction a été calculé selon la formule: Figure 1. Photographie du distillateur utilisé pour évaporer le filtrat Distillateur Ballon contenant le filtrat Thermostat Chauffe-ballon Récipient pour récupérer le solvant Rendement (%)= 𝐦𝐚𝐬𝐬𝐞 𝐝𝐞 𝐥 ′𝐞𝐱𝐭𝐫𝐚𝐢𝐭(𝐠) 𝐦𝐚𝐬𝐬𝐞 𝐝𝐮 𝐦𝐚𝐭é𝐫𝐢𝐞𝐥 𝐯é𝐠é𝐭𝐚𝐥 (𝐠) ×100 6 Figure 2. Préparation de l’extrait RAN02 2. Criblage phytochimique Pour déterminer les familles chimiques présentes dans l’extrait RAN02, un criblage phytochimique a été réalisé. Ce test est basé sur la méthode de coloration et /ou de précipitation en utilisant des réactifs spécifiques pour chaque famille chimique(FONG H.H.S. et coll., 1977). Macération dans un mélange éthanol-eau (60 : 40), à la température ambiante, 4 jours Filtration sur coton hydrophile Évaporation avec distillateur à 80°C et au bain marie à 100°C Filtrat Marc Extrait RAN02 Macérât 200 g de poudre de plante 7 Tableau I. Testsréalisés dans le criblage phytochimique de l’extrait RAN02 (FONG H.H.S. et coll., 1977). Familles chimiques Tests Réactifs Observations ALCALOÏDES DRAGENDORFF, MAYER, WAGNER Précipitation TANINS Gélatine + NaCl Précipitation verte Gélatine + FeCl3 Méthanol Précipitation Bleue COMPOSÉS PHÉNOLIQUES Gélatine 1% Précipitation STÉROÏDES ET TRITERPÈNES LIERMAN BURCHARD Anhydride acétique + H2SO4 Coloration violette BADGET KEDDE Acide picrique Coloration rouge SALKOWSKI H2SO4 Anneau de séparation rouge FLAVONOÏDES WIL-STATER Ruban de Mg + HCl concentré Coloration rouge LEUCOANTHOCYANES BATH-SMITH HCl concentré+bain marie Coloration rouge violacée ANTHOCYANES HCl à froid Coloration rouge POLYSACCHARIDES + 3Volumes d’éthanol Trouble SUCRES REDUCTEURS Liqueur de Fehling+ Bain-marie Précipitation rouge brique COUMARINES NaOH 10% Fluorescence à l’UV SAPONINES MOUSSE HCl + Agitation Persistance d’une mousse (3cm d’épaisseur) après 30mn

PARTIE PHARMACOLOGIE

L’activité de l’extrait RAN02 a été étudiée chez le cochon d’inde. Son effet sur la sécrétion intestinale a été étudié in vivo en utilisant la méthode « d’Enteropooling » provoquée par l’huile de ricin pure administrée par voie orale (AKUODORG.C. et coll., 2011), tandis que son effet sur le péristaltisme intestinal a été étudié in vitro en utilisant l’iléon isolé de cochon d’inde contracté avec l’acétylcholine (FERRON F., 2008).

Animaux d’expérimentation

Des cochons d’inde mâles et femelles âgés de 3 à 4 mois pesant entre 200 et 300 grammes ont été utilisés pour réaliser ce travail. Ils ont été acclimatés à l’animalerie de Laboratoire de Pharmacologie Générale de Pharmacocinétique et de Cosmétologie à un cycle de lumière et d’obscurité 12/12 heures avant la manipulationet nourris avec des feuilles fraiches de graminées. Les animaux ont été mis à jeun pendant 18 heures avant les tests.

Préparation de l’animal

L’extrait a été dissout dans de l’eau distillée, puis les animaux mis à jeun pendant 18 heures ont été répartis en trois lots dont un lot témoin et deux lots traités avec RAN02.Les animaux du lot témoin ont reçu 10ml/kg d’eau distillée, et les animaux des deux autres lots ont reçu respectivement 300 et 600 mg/Kg d’extrait dans 10ml/kg d’eau par voie orale (MITHIUM S.R. et coll., 2011). 3. Étude de l’effet de l’extrait sur la sécrétion intestinal Quarante-cinq minutes après l’administration de l’extrait, 1ml d’huile de ricin pure a été administré par voie orale chez tous les animaux des 3 lots (AKUODOR G.C. et coll., 2011). Trente minutes après l’administration de l’huile de ricin, les cochons d’indes ont été sacrifiés et une laparotomie a été effectuée. L’intestin grêle a été repéré, puis un nœud a été placé au niveau du pylore et un autre au niveau de la jonction iléocoecale, ensuite il a été prélevé dans sa totalité. Son contenu a été ensuite versé dans un récipient gradué et le volume du fluide intestinal a été mesuré (VENKATESAN N. et coll., 2005).

Préparation et montage de l’organe

Des cochons d’inde mis à jeun pendant 18heures ont été utilisés. Ils ont été sacrifiés et une laparotomie a été effectuée. L’iléon a été repéré puis prélevé et placé dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode aérée (Tableau II), et maintenue à la température de 37°C (MOHAMMED A. et coll., 2009). L’organe a été nettoyé en enlevant les mésentères, puis découpé en morceaux de 1,5 cm de longueur. Il a ensuite été monté dans une cuve à organe contenant 20 ml de solution de Tyrode maintenue à la température de 37° C et aérée avec de l’air, à l’aide d’un aérateur électrique KOKO-108©. Pour le fixer dans la cuve, deux crochets ont été placés, de côtés opposés, aux deux extrémités de l’organe. Ensuite un des crochets a été fixé au fond de la cuve et l’autre accroché à un capteur isométrique de marque Statham Gould© sous une tension de 1,5g (MOHAMMED A. et coll., 2009). L’organe a été laissé se stabiliser dans la cuve pendant 45 minutes. Pendant cette période, le bain a été renouvelé toutes le 15 minutes. Ensuite, de l’acétylcholine a été injectée dans le bain afin d’obtenir une concentration finale de 10-5 M pour sensibiliser l’organe (BORGES E.L.et coll., 2003). Après cette sensibilisation, l’organe a été rincé, et laissé se stabiliser de nouveau pendant 30 minutes, pendant ce temps le bain a été renouvelé toutes les 15 minutes avant de commencer les tests. Le volume total des produits injectés dans le bain n’a pas excédé 10 % du volume du bain (CAVALCANTE A.F. et coll., 2012). Les contractions ont été enregistrées avec un capteur isométrique de marque Statham Gould couplé à un ordinateur avec le logiciel SIGNAL MONITOR© développé par l’institution (I .O.G.A) Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo. Les contractions ont été enregistrées et leur amplitude a été mesurée puis 10 rapporté en fonction de la concentration de l’acétylcholine, et la CE50 de cette dernière a été déterminée graphiquement.

Étude de l’effet de l’extrait sur la motilité intestinale

Pour étudier l’effet de l’extrait RAN02 sur le péristaltisme intestinal, son effet vis-à-vis de la contraction provoquée par l’acétylcholine sur l’iléon isolé de cochon d’inde a été étudié in vitro (FERRON F., 2008). Après la sensibilisation et la stabilisation, l’acétylcholine a été injectée dans la cuve d’une manière cumulative afin de réaliser des concentrations croissantes à partir de 10- 9 M jusqu’à l’obtention de la contraction maximale de l’organe. Au plateau de contraction, l’extrait RAN02 a été injecté dans le bain d’une manière cumulative jusqu’au relâchement de l’organe. Les contractions ont été enregistrées et leur amplitude a été mesuré puis rapporté en fonction de la concentration de l’extrait dans le bain. 6. Étude du mécanisme d’action de l’extrait Le mécanisme d’action de l’extrait a été étudié in vitro, sur l’iléon isolé de cochon d’inde en pré- incubant l’organedans un bain contenant de l’extrait à différentes concentrations, avant de le contracter avec de l’acétylcholine (FERRON F., 2008). Une fois monté dans la cuve à organe isolé contenant 20ml de solution de Tyrode aérée avec de l’air et maintenue à la température de 37° C, l’iléon a été laissé se stabiliser pendant 45 minutes, puis sensibilisé avec de l’acétylcholine à la concentration de 10-5 M. Ensuite il a été rincé et laissé se stabiliser de nouveau. Pendant cette période, l’organe a été rincé toutes le 15 minutes (EZIKE A.C. et coll., 2014). Puis, l’extrait RAN02 a été injecté dans le bain afin de réaliser une concentration de 0,125 mg/ml dans le bain. L’organe a été laissé en contact avec l’extrait dans ce bain pendant 10 minutes. Après cette période d’incubation, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative afin d’obtenir des concentrations croissantes jusqu’à la contraction maximale de l’organe. Au plateau de la contraction, l’organe a été rincé, puis laissé se stabiliser de nouveau pendant 45 minutes, en le rinçant toutes les 15 minutes. La même manipulation a été répétée en pré-incubant l’organe dans un bain contenant l’extrait RAN02 aux concentrations de 0,25 puis 0,5 mg/ml dans le bain. Les contractions en présence et en absence de l’extrait ont été enregistrées et leur amplitude a été mesurée et rapporté en fonction de la concentration de l’acétylcholineet de l’extrait dans le bain. 

EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS

Les résultats ont été exprimés sous formes de moyenne avec écarts types réduits (e.s.m) puis elles ont été comparées entre elles en utilisant le test « t » de Student ; la valeur de P < 0,05 a été considérée comme significative. L’amplitude des contractions provoquées par l’acétylcholine en absence et en présence de l’extrait a été mesurée puis exprimée en pourcentage par rapport à la contraction maximale provoquée par l’acétylcholine seule. Les valeurs de CE50 ont été ensuite déterminées graphiquement.