Etude des conséquences d’une perte de méthylation de l’ADN sur la mobilisation des éléments  transposables

Cette hypométhylation étant transmise à la descendance (du moins à certains locus), on peut s’attendre à de nouveaux évènements de transposition dans celle‐ci. Alors que les nouvelles insertions produites dans le parent ddm1 ou la F1 (1 et 2) vont ségréger dans la population d’epiRIL et vont donc être présentes dans plusieurs lignées (insertions partagées), cellesComme  décrit  dans  l’introduction,  une  perte  drastique  de  la  méthylation  de  l’ADN,  telle  qu’induite  par  une  mutation  dans  le  gène  DDM1,  engendre  une  réactivation  transcriptionnelle  massive  des  ET.  Cela  dit,  il  n’est  pas  établi  dans  quelle  mesure  cette  réactivation  transcriptionnelle  des  ET  se  traduit  par  leur  mobilisation.  Afin  de  répondre  à  cette question ainsi que pour déterminer le profil d’insertion des ET, nous avons procédé au  séquençage du génome de 53 epiRIL ainsi que des deux lignées parentales.La  population  d’epiRIL  est  issue  d’un  croisement  entre  un  parent  sauvage  et  le  mutant  ddm1‐2  suivi  d’un  rétrocroisement  avec  le  parent  sauvage  à  la  suite  duquel  seuls  les  individus  homozygotes  pour  l’allèle  sauvage  du  gène  DDM1  ont  été  sélectionnés  et  autofécondés  sur  6  générations  (fig.  2.1).  Compte  tenu  du  schéma  de  croisement,  chaque  point  du  génome  est  en  moyenne  d’origine  sauvage  dans  75%  des  lignées  et  hérité  du  parent  ddm1  dans  25%  les  lignées,  sauf  bien  sûr  à  proximité  du  locus  DDM1,  systématiquement  d’origine  sauvage.  Etant  donné  que  l’hypométhylation  induite  par  la  mutation ddm1 est transmise de façon stable pour de nombreux locus, les epiRIL présentent  des profils de méthylation contrastés (fig. 2.1).

Afin d’identifier les évènements de transposition ayant eu lieu dans le mutant ddm1 ou lors  de la production des epiRIL (fig. 2.1) nous avons, en partenariat avec le Génoscope, réalisé le  séquençage  Illumina  « paired‐end »  de  banques  « mate‐pair »  du  génome  de  plus  d’une  cinquantaine  de  ces  lignées  ainsi  que  de  deux  individus  sauvages  et  d’un  mutant  ddm1  cousins des parents utilisés pour générer la population d’epiRIL.  Le  séquençage  paired‐end,  contrairement  au  séquençage  de  lectures  uniques  permet  d’identifier  des  variations  structurales  en  se  basant  sur  la  détection  de  paires  dites  discordantes, à savoir de paires dont les deux lectures ne sont pas positionnées à la bonne  distance l’une de l’autre ou mal orientées par rapport au génome de référence. Le choix de  banques  mate‐pair  permet  d’obtenir  des  lectures  appariées  situées  physiquement  à  une grande  distance  l’une  de  l’autre  (jusqu’à  plusieurs  kb),  contrairement  aux  banques  paired‐ end  classiques  qui  couvrent  de  petites  distances  (500  bp  maximum)  (fig.  2.2).  Le  choix  de  banques  mate‐pair  présente  deux  avantages  majeurs  :  (i)  elle  permet  d’augmenter  le  nombre de lectures qui soutiennent une variation structurale donnée et donc l’exhaustivité  et  la  robustesse  de  la  détection  de  ces  évènements ;  (ii)  elle  produit  une  plus  grande  couverture horizontale des variations structurales ce qui permet d’avoir des informations sur  la quasi‐totalité de la séquence insérée  et notamment sa partie interne. Cette propriété est  particulièrement  importante  dans  le  cadre  de  la  détection  de  nouvelles  insertions  d’ET  car  l’une  des  difficultés  majeures  est  l’identification  précise  du  locus  donneur.  Avec  l’approche  que nous avons choisie, même un très faible niveau de polymorphisme, où qu’il soit localisé  dans la séquence de l’ET, est suffisant pour discriminer entre plusieurs donneurs.

Afin  d’optimiser  la  détection  des  nouvelles  insertions  d’ET  basée  sur  des  données  de  séquençage  de  banques  mate‐pair,  j’ai  participé  à  l’élaboration  de  TE‐Tracker,  un  programme  spécifiquement  dédié  à  cette  problématique.  Ce  travail  est  présenté  dans  un  manuscrit en cours de finalisation, reproduit ci‐après. TEs and their abundant relics have been found in nearly all organisms and have been classied into several families based on sequence features and transposition mechanisms (Lopez-Flores and Garrido-Ramos, 2010). So-called DNA-transposons generally exhibit cut-and-paste trans- position, while retrotransposons use an ARN intermediate and thus transpose using a copy- and-paste mechanism. Retro-elements are further divided into two subclasses, depending on the presence or absence of Long Terminal Repeats (LTR). The biological role of TEs has been the subject of great controversy, and although they had been assimilated to \selsh » or \junk » DNA for some time (Doolittle and Sapienza, 1980), they are now recognized as important factors in the evolution of genome structure and function (Hurst and Werren, 2001; Rebollo et al., 2012).