ETUDE in vitro SUR TRACHEE ISOLEE
DE COBAYE

Extraction et fractionnement de l’extrait brut

Ecorce de tige

Trois cent vingt grammes de poudre de l’écorce de tige ont été macérés à la température ambiante dans un mélange hydroalcoolique (méthanol – eau : 80 / 20) et agités en continu pendant 24 heures. Cette macération a été répétée 3 fois pour avoir le maximum de rendement et suivie d’une filtration à chaque fois. Le filtrat obtenu a été regroupé puis évaporé sous vide à l’aide d’un ROTAVAPOR afin d’enlever le solvant et d’avoir un mélange concentré qui est l’extrait brut codé EET. Pour déterminer la fraction active de l’extrait EET, ce dernier a été soumis à une séparation par partage liquide-liquide: eau – dichlorométhane. Deux phases ont été obtenues: phase dichlorométhane qui a donné l’extrait ED après évaporation et la phase aqueuse qui après évaporation a donné l’extrait EA. 

Tige feuillée

Les mêmes opérations ont été effectuées pour l’extraction de l’extrait brut à partir de 1200g de poudre de tige feuillée (ETF). Pour déterminer la fraction active de l’extrait brut ETF, ce dernier a été soumis à des séparations par partage liquide-liquide avec des solvants de polarité croissante: hexane, dichlorométhane et acétate d’éthyle. L’extrait brut a été dilué dans de l’eau et après décantation, la partie insoluble (PIs1) a été reprise dans du méthanol qui a donné la fraction dénommée FM après évaporation. La partie soluble (PS1) a été partagée avec de l’hexane (volume à volume) dans une ampoule à décanter. Le mélange à été agité manuellement puis laissé se décanter pendant une heure. Ainsi, trois phases se sont distinguées : une phase aqueuse (Ph A1), une phase intermédiaire sous forme d’émulsion (Em1) et une phase organique (PS2). Elles ont été collectées séparément. La phase aqueuse (Ph A1) a été reprise avec du dichlorométhane. Après agitation et décantation, le mélange a présenté trois phases comme précédemment : une phase aqueuse (Ph A2), une émulsion (Em2) et une phase organique (PS3). La chromatographie est une méthode d’analyse immédiate et de séparation de différents constituants d’un mélange par entraînement au moyen d’une phase mobile le long d’une phase stationnaire (13-16). L’analyse sur CCM (Chromatographie sur Couche Mince) des deux phases intermédiaires Em1 et Em2 nous a permis de les regrouper en Em3. Elles ont présentées beaucoup de similarité en termes de nombre et migration des tâches chromatographiques. Ce mélange est dénommé FI après évaporation. Pour cette CCM, le système de solvants utilisé est un mélange acétate d’éthyle – acétone (6 / 4) et le révélateur a été une solution à vanilline. Cette solution à vanilline a été obtenue après dissolution de 1g de poudre de vanilline dans 100 ml de méthanol et 5 ml d’acide sulfurique. Après analyse sur CCM, le même constat a été observé avec les phases organiques issues du partage eau – hexane (PS2) et eau – dichlorométhane (PS3). PS2 et PS3 présentent le même profil chromatographique sur CCM réalisée sous les mêmes conditions que précédemment. Ainsi, elles ont été regroupées pour donner la fraction FII après évaporation. La phase aqueuse Ph A2 a été partagée avec de l’acétate d’éthyle. Deux phases ont été obtenues, une phase aqueuse Ph A3 donnant la fraction FA après évaporation et une phase acétate éthylique Ph AE qui après évaporation a donné la fraction FAE.

 Fractionnement bioguidé de la fraction FAE′

Dans le but de déterminer les molécules responsables de l’activité biologique de la plante, des séries de fractionnement de FAE′ ont été effectuées. La fraction FAE′ a été partagée entre l’eau et l’acétate d’éthyle. Après décantation, on a obtenu deux phases. Après séparation et évaporation, deux fractions ont été obtenues: la fraction Fae qui est la fraction obtenue après évaporation de la phase organique et la fraction FH2O obtenue après évaporation de la phase aqueuse. Ces deux fractions et la fraction FAE′ ont été analysées à l’aide d’une CCM. Le système de solvants utilisé a été : acétate d’éthyle – méthanol – hexane – ammoniaque (7 / 1 / 1,98 / 0,02). La révélation a été faite avec la vanilline. La fraction FH2O a été fractionnée à son tour par chromatographie sur colonne (15) sur gel de silice RP-18 (SORBSILTM C60) 40-60 µm de diamètre. Une colonne de verre dont la hauteur est de 80 cm et le diamètre est de 2,5cm a été utilisée. Les solvants d’élution utilisés ont été le dichlorométhane – acétone (4/6  6/4) suivant un mode d’élution par gradient. A la fin de la chromatographie, les différentes fractions collectées ont été analysées par CCM, les fractions qui renfermaient les mêmes produits ont été regroupées. Le système de solvants utilisés a été : acétate d’éthyle – méthanol – hexane (8 /1 /1). La révélation a été faite avec la vanilline. Après regroupement et évaporation, 10 fractions ont été récupérées (F1 à F10). Une analyse comparative par CCM de la fraction FH2O et de la fraction active F8 a été réalisée avec un système de solvants composé de acétate d’éthyle – méthanol – hexane (8 /1 /1) et une révélation faite avec la vanilline.