Génotoxicité

– les cassures (simples et doubles brins) sont des lésions correspondant à la rupture d’un ou des deux brins de la molécule d’ADN. Les cassures doubles peuvent avoir lieu à la même position ou bien à des positions très proches. Ces lésions peuvent être induites par de nombreux facteurs (espèces réactives de l’oxygène (ROS), par exemple) ou par des radiations ionisantes comme les rayons X ou gamma. Les cassures doubles brins sont considérées comme des dommages particulièrement délétères car difficilement réparables. Moins fréquemment, des pontages intra ou inter-brins apparaissent, correspondant à des liaisons covalentes anormales entre des bases de l’ADN et des cassures simples ou doubles brins (Dégremont et Cachot, 2009). Des additions, des substitutions ou des délétions de bases peuvent avoir lieu au sein de la double hélice d’ADN avec des répercussions potentielles sur les protéines issues de l’expression des gènes concernés par ces mutations. Enfin, des lésions oxydatives du matériel génétique peuvent être générées lors de l’attaque des bases de l’ADN (généralement la guanine) par des ROS. d’organisation biologique, et à terme avoir des répercussions sur la dynamique des populations (Vasseur et al., 2008). Cependant, les cellules possèdent plusieurs mécanismes spécifiques permettant de contrôler l’intégrité du patrimoine génétique puis le cas échéant de le réparer. Il existe deux types de systèmes de réparation : les mécanismes conservatifs d’excision re-synthèse qui garantissent une réparation fidèle, et les systèmes dits fautifs qui interviennent dans un second temps lorsque les mécanismes conservatifs sont dépassés par l’abondance des lésions de l’ADN. Ces systèmes fautifs permettent une réparation d’urgence qui autorise alors la reprise de la réplication de l’ADN mais ne garantissent pas le maintien de l’intégrité de cet ADN (Dégremont et Cachot, 2009).

Méthodes d’analyse de la génotoxicité en écotoxicologie

En écotoxicologie, 2 méthodes de mesure/détection des signes de génotoxicité sont couramment utilisées, chacune d’elles présentant des avantages et des inconvénients. Les paragraphes suivants décrivent succinctement ces 2 méthodes : l’essai comète et le test des micronoyaux. Enfin, une 3ème méthode utilisée depuis une quinzaine d’années en écotoxicologie, la PCR par amorçage aléatoire ou Random Amplified Polymorphic DNA  Le test des comètes ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) a été mis au point en 1984 par Ostling et Johanson. Il a permis de détecter les cassures doubles brins chez des cellules isolées de mammifères. En 1988, Singh et al. ont adapté la méthode pour permettre la détection des cassures doubles et simples brins sur des lymphocytes humains. Le nom de ce test vient de la visualisation des noyaux endommagés qui prennent l’aspect de comètes classiquement observées en astronomie avec une tête et une queue (Figure I-4). Le test des comètes est une technique d’électrophorèse sur microgel d’agarose. Il permet la détection spécifique de cassures simples et doubles brins ou la mise en évidence d’une fragmentation de l’ADN synonyme d’apoptose (mort cellulaire programmée). Ce test est effectué sur un même type cellulaire et requiert parfois une étape de dissociation. En écotoxicologie, il a été couramment utilisé sur de nombreux groupes d’organismes : plantes, planaires, oligochètes, mollusques gastéropodes et bivalves, crustacés, insectes, échinodermes, poissons, amphibiens et mammifères (Jha, 2008).

La méthodologie de ce test est la suivante : les cellules isolées sont emprisonnées dans un gel d’agarose puis lysées (souvent en milieu alcalin). L’ADN dénaturé est séparé par électrophorèse puis coloré au bromure d’éthidium. Les noyaux dont l’ADN a subi des cassures vont présenter une forme de comète tandis que les noyaux dont l’ADN n’est pas lésé apparaissent sous forme d’un cercle (Figure I-4). Une évaluation semi-quantitative (classement en quatre catégories) ou quantitative (évaluation du Tail-moment) des taux de dommages est ensuite réalisée. L’analyse des résultats s’effectue la plupart du temps de manière quantitative à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Généralement, les données sont exprimées en pourcentage du nombre de cellules ayant subies des dommages (ou pourcentage de comètes) dans la population cellulaire étudiée (Cotelle et Férard, 1999). Les principaux avantages du test comète sont les suivants : il nécessite peu de matériel et il est applicable à de nombreux organismes. La méthodologie est simple, rapide et peu couteuse. Ce test très sensible permet une détection spécifique des cassures doubles et simples brins ainsi que des sites alcali-labiles. Il est généralement utilisé sur des cellules circulantes ne nécessitant pas de dissociation préalable : érythrocytes de poissons (Galindo et al., 2010), cellules sanguines de branchies chez D. rerio (Rocco et al., 2010), cœlomocytes (cellules immunitaires) de vers de terre (Fourie et al., 2007), hémolymphe d’escargots terrestres (Leffa et al., 2010 ; Itziou et al., 2011a,b).