Analyse génétique

La génétique bactérienne

Jacob et Moneau ont démontré qu’il existe des gènes chez les bactéries. Ils ont eu un prix Nobel pour avoir montré qu’il y avait des gènes de régulation. La génétique bactérienne permet la mise en place de l’ingénierie des bactéries, pour leur faire produire des molécules, par exemple pour faire des vaccins. On est aujourd’hui capable de modifier l’ADN des bactéries pour leur faire produire la molécule voulue.

Les bactéries

Elles sont partout, aérobies et anaérobies, leur taille est de 1µm, les cellules animales font entre 10 et 100 µm (La plus grosse cellule naturelle est l’œuf d’autruche). On peut regarder les bactéries en milieu liquide ou étalées en colonies sur des boites de Pétri. Elles peuvent vivre dans des conditions extrêmes, en s’adaptant. C’est cette adaptation que l’on utilise pour faire des amplifications d’ADN. Ces organismes ont un génome circulaire. Celui d’E. coli mesure 4,5.10⁶ paires de bases. Le génome humain mesure 3,3.10⁹ paires de bases. Le nombre de gènes d’un génome de mammifères  fait 20 à 25 000 gènes. E. coli en fait 4 000.Le point essentiel de la manipulation d’E. coli est que sa croissance est rapide. Le doublement de population se fait en 20 minutes. Une bactérie en redonne un million en moins de 7 heures. La croissance peut se faire en haute densité, jusqu’à 10⁹ à 10¹⁰ bactéries par mL.

Croissance en liquide

La croissance en liquide est utilisée pour la production de biomasse, dans un fermenteur. La croissance peut être suivie en utilisant un spectrophotomètre. L’étalonnage entre DO et nombre d’individus peut se faire en utilisant la dilution en série et des étalements sur boite. La croissance présente 3 phases :

• Phase de latence
• Phase exponentielle : c’est là que les bactéries sont en bonne santé
• Phase stationnaire : milieu épuisé, les bactéries s’arrêtent de croitre, plus assez de nutriments

 Croissance sur boite

L’intérêt est que l’on peut étudier des millions de bactéries, et on peut le faire en 12 heures. On ne peut pas, par exemple, faire ça avec des mouches. On dit que seule la génétique bactérienne est capable de mettre en place les cribles les plus puissants. Une colonie représente environ 10⁷ cellules.On fait des clonages.

Caractéristiques de la croissance sur bactéries

2 termes à retenir :

• Prototrophe : apte à croitre sur un milieu minimum
• Auxotrophe : apte à croitre sur un milieu supplémenté par des substances non requises pour la croissance du sauvage.

Le taux de mutation des gènes est variable d’un gène à l’autre. En générale, on a 1 mutant pour 10⁵ individus à 1 pour 10⁷. Mais il existe aussi des cas particuliers, qui mutent à 1/100. Pour isoler des mutants, la technique la plus souvent employée est la technique des répliques.

Recherche des mutants

• Crible négatif : pour la plupart des auxotrophies, les mutants d’auxotrophie qui nécessitent quelque chose pour croitre. On n’a pas les moyens de sélectionner le mutant.
• Crible positif : opposé au crible négatif. Par exemple, la résistance aux antibiotiques. Ici, on sélectionne le mutant. Exemple : on cherche des mutants résistants à la streptomycine. Classiquement, la population est sensible. Donc de bactéries sensibles on veut aller vers des résistantes. De plus, on étudie des bactéries qui nécessitent de l’arginine pour croitre, et on veut des bactéries qui n’en ont pas besoin. Le premier est un crible positif, le second est négatif. En effet, pour la streptomycine, on met 10⁸ bactéries sur boite de pétri, et on rajoute de la streptomycine. Seuls les mutants résisteront, et donc on les aura directement. Pour le second, on prend une boite avec milieu minimal + arginine, et on met des bactéries. On met du velours là dessus, pour prendre quelques bactéries de chaque colonie, puis on les réplique sur milieu minimum sans arginine. On va obtenir des colonies, et pour chaque colonie du milieu minimum, on prendra son homologue sur la première boite, elle sera arginine^–.2^ème exemple, on a des Gal⁺, on cherche des Gal^–, par un crible négatif. On va faire une culture en milieu minimal + Glu, et on réplique sur milieu minimal + Gal. Puis idem, homologues. On essaie de favoriser le crible positif car il est plus facile à utiliser.