LE DOSAGE DES NSC ISSUS DE LA DYNAMIQUE RAMEALE

Extraction au mélange ternaire (MeOH, CH3OH, H2O) des sucres solubles

1) Séchage de la poudre : Sécher les poudres lyophilisées en étuve à 40-50°C (une matinée ou une nuit). 2) Pesée : Peser 10 mg(*) de matière sèche lyophilisée dans un tube T1. (*) : On peut peser de 3 et 6 mg si vraiment peu de matière. 3) Extraction 1 : Passage des composés polaires et apolaires en solution et séparation par rapport aux débris cellulaires. – Extraire avec 0,8 ml de méthanol/chloroforme/eau (12/5/3, v/v/v). – Attendre 30 min à 20 °C. – Centrifuger 10 min à 5°C et 2000 g. – Récupérer le surnageant dans un tube T2. – Renouveler l’opération 1 x afin d’épuiser l’échantillon, en joignant le 2ème surnageant au premier. – Sur le culot résiduel, mettre 1 ml de méthanol à 60 % (v/v) et placer au frigo en attente de l’extraction de l’amidon. 4) Extraction 2 : Extraction des métabolites polaires (acides organiques, acides aminés solubles, protéines, sucres solubles …) contenus dans le mélange des 2 surnageants précédents. – Ajouter aux surnageants (env. 2,4 ml) : 2 ml de méthanol/chloroforme (v/v). 0,8 ml d’eau distillée. – Agiter au vortex. – Centrifuger 5 min à 2000g – Récupérer la fraction légère incolore (aqueuse) dans un tube T3. (Attention ! Ne prélever que la phase supérieure). – Sur la fraction lourde, ajouter 1 ml de méthanol à 60 %. – Agiter au vortex. – Centrifuger 5 min à 2000g. – Récupérer la fraction légère et la joindre à la première. 5) Evaporation : Conseil : Placer 30 minutes les tubes T3 au congélateur avant de les mettre dans l’évaporateur sous vide pour éviter les rejets lors du pompage. 191 Pendant ce temps mettre en route l’évaporateur sous vide. Evaporer à sec dans un évaporateur sous vide (une nuit). 6) Matériel nécessaire : – -Blouse de labo – Travail sous hotte ou sorbonne – Gants jetables imperméables aux solvants – Spatule de pesée – Minuteur – Tubes type eppendorf 2ml à vis – Tubes polypropylène 5 ml (ou tubes hémolyse en verre renforcé de 6 ml) – Vortex – Pipettes 1ml (et embout pipette) et 5 ml – Ultra-centrifugeuse réfrigérée – Balance de précision – Congélateur -20°C – Evaporateur sous vide – Glace pilée – Eau distillée ou ultrapure – Méthanol – Chloroforme Remarques importantes: * Tubes : Matières résistant au CHCl3 et CH3OH: verre, polypropylène, polyéthylène (LPDE, HPDE), ou téflon (PFA, PTFE). Diamètre 13 mm, 6 ml minimum, bouchons (silicone…). * Dès que les sucres se trouvent en milieu aqueux (extraction 2), il faut aller vite et éventuellement stocker au froid (-20°C) car ils peuvent subir des transformations ou stocker les tubes à -20°C en attente du dosage.

 Extraction au méthanol 70% à froid des sucres solubles 

Séchage de la poudre 

Sécher les poudres lyophilisées en étuve à 40-50°C (une matinée ou une nuit).

Pesée

Peser entre 5 et 10 mg de poudre lyophilisée dans un tube T1 (eppendorf 2ml à vis). La fiabilité des dosages dépend intégralement de la finesse de la poudre. Précision de la pesée au 10 ème de mg (donc peser sur une balance suffisamment précise). 

Extraction

– Ajouter 650 μl de méthanol à 70% (méthanol/eau, 7/3, v/v). – Vortexer. 192 – Laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. – Centrifuger à 17 000 g pendant 5 min. – Transférer le surnageant à la pipette dans un tube (T2) de 5mL en polypropylène. – Répéter l’extraction 2 fois. – Rassembler les 3 surnageants dans le tube T2. – Sécher les surnageants dans un évaporateur à rotation sous vide d’air pendant 12 heures. – Placer le tube T1 contenant le culot insoluble au congélateur à -20°C en attente de l’extraction d’amidon. 4) Evaporation : Conseil : Placer 30 minutes les tubes T2 au congélateur avant de les mettre dans l’évaporateur sous vide pour éviter les rejets lors du pompage. Evaporer les tubes T2 à sec dans un évaporateur sous vide (une nuit). Stocker les tubes T1 et T2 bouchés au congélateur à -20°C en attente de l’extraction de l’amidon et du dosage des sucres. 5) Matériel nécessaire : – -Blouse de labo – Travail sous hotte ou sorbonne – Gants jetables imperméables aux solvants – Spatule de pesée – Minuteur – Tubes type eppendorf 2ml à vis – Tubes de 5 ml polypropylène ou (tube hémolyse en verre 6m ml) – Vortex – Pipette 1ml (et embout pipette) – Ultra-centrifugeuse réfrigérée – Balance de précision – Congélateur -20°C – Evaporateur sous vide (avec piège à froid à -100°C) – Eau distillée ou ultrapure – Méthanol 

Méthode n°3 : Extraction à l’éthanol à 80% à chaud des sucres solubles 

Séchage de la poudre 

 Sécher les poudres lyophilisées en étuve à 40-50°C (une matinée ou une nuit). 1) Pesée : Peser entre 5 et 10 mg de poudre lyophilisée dans un tube T1 (eppendorf 2ml à vis). La fiabilité des dosages dépend intégralement de la finesse de la poudre. Précision de la pesée au 10 ème de mg (donc peser sur une balance suffisamment précise).

Extraction 

 Cette méthode permet d’extraire tous les composés solubles dans l’éthanol et l’eau : les métabolites polaires (acides organiques, acides aminés, sucres…) et des composés apolaires (pigments hydrosolubles …). NB : Les sucres peuvent subir des transformations en milieu aqueux (présence d’enzymes), il faut donc les mettre dans un bac de glace pendant les manipulations et les stocker au froid à – 20°C – Ajouter 1 ml d’éthanol à 80%. – Vortexer. – Incuber au bain marie à 80°C pendant 30 mn. – Centrifuger 10 mn à 10000 g. – Récupérer grossièrement le surnageant à la pipette dans un tube T2 (polypropylène, 5 ml ou tube à hémolyse verre 6 ml), maintenir dans la glace. – Renouveler l’extraction d’extraction 2 fois. – Evaporation des tubes T2 (contenant les 3 surnageants soit env. 3 ml) à sec et à froid dans un évaporateur sous vide pendant 5h environ. 

Evaporation 

 Conseil : Placer 30 minutes les tubes T2 au congélateur avant de les mettre dans l’évaporateur sous vide pour éviter les rejets lors du pompage. 

Evaporer les tubes T2 à sec dans un évaporateur sous vide (une nuit). Stocker les tubes T1 et T2 bouchés au congélateur à -20°C en attente de l’extraction de l’amidon et du dosage des sucres. 4) Matériel nécessaire : – -Blouse de labo – Gants jetables imperméables aux solvants – Tubes type eppendorf 2ml à vis – Spatule de pesée – Minuteur – Tubes polypropylène 5ml (ou tubes hémolyse en verre 6 ml) – Bain marie – Vortex – Pipette 1ml (et embout pipette) – Ultra-centrifugeuse réfrigérée – Balance de précision – Congélateur -20°C – Evaporateur sous vide – Glace pilée – Eau distillée ou ultrapure – Ethanol