Rôle d’ETTIN/ARF3 dans le développement du carpelle chez Arabidopsis thaliana

Milieux et conditions de culture – Culture en terre

Les graines d’Arabidopsis semées sur terre sont cultivées sur du terreau en condition de jour long (jour : 18h à 20°C, nuit : 6h à 18°C) ou en jour continu à 16°C. – Culture in vitro L’ensemble des manipulations de culture in vitro sont réalisées en conditions stériles sous hotte à flux laminaire. Les graines sont, dans un premier temps, stérilisées par 5 min d’incubation dans un mélange chlore éthanol (3,5g de chlore dissout dans 40ml d’eau millipore diluée au cinquantième dans de l’éthanol 96%). Après incubation, la solution est éliminée et les graines sont rincées trois fois avec de l’éthanol 96% puis séchées à l’air libre sous hotte toute la nuit. Les graines peuvent ensuite être semées sur milieu gélosé ou en milieu liquide. Le milieu gélosé est composé de MS (Duchefa, 4,3g/l) ; saccharose (10g/l) ; Plant-Agar (8g/l) ; pH 5,7 (KOH). Il est stérilisé par autoclavage puis est supplémenté ou non en antibiotiques. Pour la culture liquide, les graines sont immergées dans un milieu nutritif MS/2 (MS (Duchefa, 2,15g/l) ; glucose (5g/l) ; MES (0,5g/l) ; pH 5,7 (KOH)) et agitées à 200tour/mn. Le milieu nutritif est renouvelé après 7 jours de culture. 

Croisements

Les croisements sont effectués sous la loupe binoculaire à l’aide de pinces fines. On sélectionne, sur la plante femelle, des bourgeons floraux tardifs mais clos, le pistil doit être à un stade de développement avancé sans que les anthères ne soient déhiscentes afin d’éviter les risques d’autofécondation. L’ensemble des pièces florales, excepté le pistil, sont éliminées des bourgeons sélectionnés. Sur le stigmate de ce pistil nu, on dépose le pollen provenant du parent mâle en frottant les étamines déhiscentes sur le stigmate. Les graines sont récoltées après maturation de la silique. C- Traitement à l’auxine Les plantules contenant la construction pDR5::VENUS sont immergées dans des bains contenant différentes concentrations d’auxine (3-indoleacetic acid de chez SIGMA) diluée dans un milieu nutritif MS/2 ((MS (Duchefa, 2,15g/l) ; glucose (5g/l) ; MES (0,5g/l) ; pH 5,7 (KOH)). Après 2 heures d’incubation, les plantules sont soit prélevées pour quantifier le niveau de transcrit VENUS, soit replacées en chambre de culture pour observer ultérieurement le patron d’expression de DR5 en microscopie confocale. D- Préparation de la construction p35S ::ARF4-GR Pour préparer la construction d’intérêt, la technologie Gateway a été utilisée. Commercialisée par la société Invitrogen, la technologie Gateway s`appuie sur les propriétés de recombinaison homologue d’une enzyme de bactériophage au niveau des sites spécifiques att, utilisés naturellement pour l’intégration du bactériophage dans le génome d’E. coli. Ce mécanisme a été détourné pour en faire un système de recombinaison in vitro. Une recombinaison de LR Triple permet d’incorporer simultanément trois éléments dans un vecteur d’expression. Les vecteurs d’entrée contenant le promoteur 35S et la séquence codante de GR était disponible au laboratoire. J’ai donc amplifié par PCR la séquence codante du gène ARF4 sans codon stop flanqué des 2 sites de recombinaison spécifique, attB1 en amont, et attB2 en aval. Les extensions attB sont encadrées en rouge. Figure IV-1 : Carte du vecteur permettant l’expression d’ARF4 fusionné à GR sous le contrôle du promoteur fort p35S. Spectino Kan ARF4 nostop attB1 attB2 attB3 attB4 p35S Promoter NOS LB RB 19s TER Ter 3′ OCS GR Expression clone/pArt27/ARF4cds 14712 . Par réaction de BP clonase, cet amplicon flanqué des sites attB, est inséré dans le vecteur donneur pDONR207 (Invitrogen) possédant les sites attP1 et attP2. Grâce à cette recombinaison, le vecteur donneur est modifié et forme le vecteur d’entrée. Ce vecteur d’entrée contient les sites de recombinaison homologue attL1 et attL2 encadrant la séquence codante du gène ARF4. Par réaction de LR triple, les trois vecteurs d’entrée possédant les séquences d’intérêts (p35S, ARF4 et GR) recombinent avec le vecteur pArt27 pour former le vecteur d’expression possédant la construction p35S::ARF4-GR (Figure IV-1).

Transformation des plantes

La souche LBA 4404 d’A. tumefaciens a été utilisée pour la transformation des plantes. Des vecteurs binaires dérivés du plasmide pArt27 (Figure IV-1), portant le trangène à intégrer dans le génome de plantes, sont transférés dans A. tumefaciens à l’aide d’un électroporateur (Micropulser, Biorad). Pour chaque transformation de plante, un clone d’A. tumefaciens portant le plasmide d’intérêt est mis en culture dans un incubateur agitant à 28°C dans 20 ml de milieu LB contenant de la spectinomycine (100mg/ml). Cette pré-culture est ensuite utilisée pour inoculer 800 ml de LB- spectinomycine. Lorsque la densité optique de la culture atteint 1,6-1,8 (~18 heures plus tard), les bactéries sont centrifugées pendant 15 min à 5000 g, puis le culot est repris dans 800 ml de milieu d’infiltration (5% saccharose, 10 mM MgCl2 et 0,01% Silwet (détergent)). Ce mélange est utilisé pour la transformation de plantes. Les inflorescences des plantes d’A. thaliana (Ecotype Col-0) sont immergées pendant 2 mn dans le milieu d’infiltration contenant la solution bactérienne. Les plantes ainsi traitées sont placées une nuit en atmosphère humide, puis cultivées en chambre de culture. Les graines issues de la première génération (T1) sont récoltées, puis semées sur un milieu gélosé MS supplémenté de kanamycine à 50mg/ml permettant de sélectionner les transformants, grâce à la présence du gène de résistance dans la construction. Les plantes résistantes sont repiquées en terre et placées en cellule. Ces plantes (T1) sont cultivées jusqu’à obtention des graines T2. A la génération T2, l’expression du transgène est vérifiée par RT-PCR. Les lignées présentant des insertions uniques sont sélectionnées grâce au gène de résistance par étude de la ségrégation du transgène. Enfin, les lignées homozygotes pour le transgène sont sélectionnées en génération T3. 77 F- Obtention de gènes tronqués par mutagenèse dirigée A partir du plasmide pETM11 contenant la séquence codante du gène CRC (disponible au laboratoire), j’ai réalisé des PCR avec la polymerase Taq phusion high fidelity (Finnzymes) selon les instructions du fabricant. Les oligonucléotides sont dessinés de part et d’autre de la séquence à éliminer. Ils sont également phosphorylés à leur extrémité 5’ pour permettre la ligation. Le produit PCR est purifié à l’aide du kit QIAquick PCR Purification (Qiagen) puis élué dans 50µl d’eau. 20µl de l’éluât est digéré par l’enzyme DpnI (Invitrogen) selon les instructions du fournisseur. L’enzyme DpnI coupe uniquement l’ADN méthylé c’està-dire le plasmide de départ. Le produit de la digestion est déposé sur gel d’agarose. Après la migration, la bande correspondant au produit PCR est découpée puis le kit DNA Gel Extraction (Millipore) est utilisé pour extraire l’ADN du gel d’agarose. Estimer la quantité d’ADN, puis utiliser une quantité d’ADN inférieure à 200ng pour réaliser la ligation. La ligation s’effectue avec le kit Rapid DNA ligation (Roche) selon les instructions du fournisseur. Les plasmides obtenus sont utilisés pour transformer les bactéries Echerichia coli DH5α compétentes par choc thermique. G- Induction à la Dexaméthasone Les inductions se font soit sur des inflorescences soit sur des plantules possédant les transgènes p35S ::ETT-GR ou p35S ::ARF4-GR. Les tissus à induire sont préalablement immergés deux minutes dans une solution de cycloheximide (10µM, inhibiteur de la traduction) contenant 0,1% de Tween20. Une heure après le traitement, les plantes sont traitées soit par une solution contenant de la cycloheximide (10µM), de la dexaméthasone (10µM) et 0,1% de Tween20, soit par une solution contenant de la cycloheximide (10µM), de l’éthanol (solvant de la dexaméthasone) et 0,1% de Tween20. Les échantillons sont récoltés deux heures après traitement et stockés à -80°C.