Techniques existantes de préparation de mimes de globules rouges

Technique « couche par couche »

La technique appelée « couche par couche » ou « Layer by Layer » (LbL) (Doshi et al. 2009) (She et al. 2013) consiste à construire des microcapsules de polymères à l’aide de particules modèles qui sont biconcaves et discoïdales, c’est-à-dire de même forme que les GRs, comme sur la Figure 5. Pour cela, la méthode « jetting électrodynamique » ou « pulvérisation électronique » (« electrospraying ») est appliquée. Une solution d’acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA) est d’abord mise dans une seringue qui est poussée par un pousse-seringue. Puis un capillaire est connecté à l’aiguille au bout de la seringue et une tension positive est appliqué entre la seringue et une feuille d’aluminium (à tension=0), placée en dessous du capillaire pour collecter les particules pulvérisées. Leur taille est influencée par le débit et la tension appliqués. Puis, ces particules sont incubées dans le propan-2-ol, ce qui transforme la forme de sphérique en biconcave et discoïdale. Le même effet peut être obtenu en mettant le PLGA et le propan-2-ol dans deux seringues différentes avant d’effectuer le processus de « jetting électrodynamique ».

Ensuite, des polymères anioniques et cationiques sont ajoutés à leur surface de manière alternative. Après le dépôt d’un certain nombre de couches, la réticulation est réalisée pour renforcer la stabilité. Le noyau en PLGA est ensuite dissous en utilisant un mélange de tétrahydrofurane (THF)/propan-2-ol, ce qui donne des microcapsules de même forme que les GRs. Basée sur le même principe, d’autres matériaux peuvent aussi être choisis pour construire le noyau et les couches. Par exemple, She et al. utilisent des particules d’hydroxyde de calcium (Ca(OH)2) préalablement traitées par du sulfate de dextran, comme noyau (She et al. 2013). En outre, la méthode « LbL » est performante pour retrouver les propriétés des GRs comme la taille, la forme, le module élastique et les fonctionnalités. Cependant, le processus comprend plusieurs étapes physiques et chimiques ce qui prend quelques jours pour une préparation. De plus, l’utilisation de produits chimiques toxiques comme le THF demande des précautions supplémentaires pendant la préparation. L’étude des méthodes existantes de préparation de mimes de GRs montre les avantages d’une part de l’émulsification en termes de quantité de microparticules produites dans un temps court et de simplicité de mise en oeuvre et d’autre part des techniques « digitales » en termes de contrôle en taille, en forme et en propriétés des microparticules. Cependant, pour les applications en mesures optiques et ultrasonores, nous sommes surtout intéressés par la production d’une grande quantité de microparticules monodisperses avec une taille et des propriétés mécaniques contrôlées proches des GRs et sans présence de tensioactifs.

Choix de l’hydrogel

Les hydrogels sont définis par « des réseaux polymères réticulés hydrophiles, capables d’absorber et de garder une quantité significative d’eau dans leur structure » (Rosiak and Yoshii 1999) (Hoffman 2012) (Caccavo et al. 2018). Ainsi ils peuvent présenter des propriétés mécaniques variées suivant le taux de réticulation et/ou la teneur en eau. Ce sont donc des matériaux adaptés pour mimer les GRs. La définition ci-dessus se focalise sur la structure chimique et l’interaction avec l’eau, mais sans imposer l’existence d’eau à l’intérieur. C’est pour cette raison que la nomination de « hydrogel sec » est trouvée dans certaines publications (Fonteno and Bilderback 1993) (Satarkar and Zach Hilt 2007) (Hoffman 2012). D’ailleurs, on mesure la capacité de gonflement des hydrogels, en comparant l’hydrogel avant et après hydratation (Lee et al. 2000) (Wu et al. 2018). Ainsi, deux propriétés sont reconnues pour les hydrogels :

1) les hydrogels gonflent en présence d’eau dû aux groupes fonctionnels hydrophiles ;

2) les hydrogels ne se dissolvent pas dans l’eau dû à la structure du réseau formé après gélification (processus qui est détaillé en III.

3.) (Ahmed 2015). Les hydrogels sont activement étudiés depuis plus de 50 ans, dans des domaines variés comme en biomédical et en pharmaceutique (Maitra and Shukla 2014) (Ahmed 2015).

La première application biologique d’hydrogels a été publiée en 1960 par (Wichterle and Lim 1960), en tant que matériau compatible avec les tissus, capable de contenir de l’eau et perméable aux métabolites. Ces propriétés de biocompatibilité et de similarité avec la structure intracellulaire ont ainsi motivé l’utilisation des hydrogels en biomédecine (Hoffman 2012) (Agüero et al. 2017) et en ingénierie tissulaire (Lee and Mooney 2012). Avec le développement des technologies biomédicales, les microparticules d’hydrogel sont souvent utilisées comme matrice pour encapsuler des agents bioactifs (médicaments, protéines, cellules, etc.). Ces agents sont ainsi protégés avant d’être libérés. L’encapsulation peut aussi fournir un environnement in vivo qui permet la prolifération des cellules pour réparer ou régénérer des tissus, mais aussi pour générer des produits biomédicaux (Utech et al. 2015). Grâce à la biocompatibilité des hydrogels, il n’y a pas d’irritation ou de rejet par le système immunitaire du patient, ce qui garantit la réussite de la circulation dans le corps et de la libération des objets encapsulés.

Mélange après la génération de gouttes

Pour mélanger l’alginate et le cation après la génération des gouttes, Xu et al. ajoutent une entrée supplémentaire d’eau au moment du mélange, jouant le rôle de tampon entre les 2 solutions d’alginate et de cation, ce qui permet d’éviter le contact direct entre alginate et Ca2+ dans le canal (Figure 24 (a)). Ce fluide est ensuite « pincé » par deux flux d’octanol par « flow-focusing », générant des gouttes d’alginate de calcium (Ca-alginate). Dans le canal en forme de serpentin qui suit, la gélification a lieu transformant les gouttes en microparticules qui sont monodisperses (Figure 24 (b)). Une autre méthode consiste à faire fusionner une goutte d’alginate et une goutte de CaCl2 (Liu et al. 2006). Dans une puce en PDMS (Figure 25 (a)), les gouttes d’alginate (Figure 25 (b)) et celles de CaCl2 (Figure 25 (c)) sont générées séparément dans de l’huile de soja par « flow-focusing ». Elles se rejoignent dans une jonction en T et deux chambres circulaires successives (Figure 25 (d, e)) permettent de les fusionner. Puis les gouttes du mélange gélifient dans le canal. En variant les débits et la géométrie des canaux, des microparticules de gel de différentes formes et tailles sont obtenues (Figure 25 (f)).

Cependant, afin de garantir l’homogénéité de la composition des microparticules, la fusion des gouttes doit être effectuée de manière reproductible, ce qui demande beaucoup d’essais. Cette méthode est donc relativement compliquée à mettre en oeuvre. Une méthode alternative de fusion consiste à faire rencontrer les gouttes d’alginate avec un flux de cation. La Figure 26 montre le montage pour envoyer un flux de solution aqueuse de BaCl2 dans des gouttes aqueuses d’alginate générées par « flow-focusing » en amont (Figure 26 (a)) (Trivedi et al. 2010). Comme l’énergie interfaciale entre l’huile et les phases aqueuses est importante, à chaque passage de gouttes, le flux de solution de BaCl2 préfèrera fusionner avec la goutte d’alginate. L’efficacité de la fusion est validée à l’aide d’un colorant (Figure 26 (b)). 38 Figure 26. (a) Montage pour la génération de gouttes d’alginate dans de l’huile de silicone en utilisant des capillaires en Téflon. (b) Un flux de BaCl2 dans une jonction en T (Trivedi et al. 2010) Le risque de cette méthode est la génération de gouttes de BaCl2 entre les gouttes d’alginate (Trivedi et al. 2010). C’est le cas lorsque l’huile est peu visqueuse ou lorsque l’énergie interfaciale entre l’huile et les phases aqueuses est faible. Pour chaque méthode présentée, les gouttes du mélange (alginate + cation) gélifient rapidement, avant que la diffusion de cation soit homogène dans les microparticules (Utech et al. 2015). Ainsi la structure interne des microparticules ne doit pas être homogène. Pour ralentir la gélification, il faut que le cation soit libéré lentement dans les gouttes du mélange.

Forme inactive du cation dans l’élément X2+Y2- Zhang et al. utilisent du carbonate de calcium (CaCO3) dont le cation Ca2+ est libéré seulement en présence d’un pH acide (Figure 27 (a)) (Zhang et al. 2007). Ils dispersent du CaCO3 dans la solution d’alginate. Ce mélange aqueux est émulsifié par de l’huile de soja par « flow-focusing », donnant des gouttes d’alginate/CaCO3 (Figure 27 (b)). Comme l’huile contient de l’acide acétique, le pH diminue et les cations Ca2+ sont libérés du CaCO3, déclenchant la gélification de l’alginate. Les microparticules de gel sont alors formées et collectées dans l’huile (Figure 27 (c)). Cependant, ils observent que les microparticules se dissolvent dans l’eau. De plus les modules de Young mesurés sont faibles (𝑬=3,9±0,19kPa). Ceci est dû à une gélification insuffisante dans le canal microfluidique. La gélification peut être renforcée en ajoutant du CaCO3. Mais l’ajout de CaCO3 risque de produire des agrégats, ce qui cause des problèmes de colmatage du canal. Le même principe est appliqué à la préparation de microparticules encapsulant des cellules (Akbari and Pirbodaghi 2014). Puisque le contact mécanique avec CaCO3 réduit la viabilité cellulaire, dans la puce microfluidique (Figure 28 (a)), le fluide de cellules coule en coaxial avec celui de CaCO3 afin de limiter le temps de contact entre les cellules et le CaCO3 (Figure 28 (b)).

L’huile de fluorocarbure contenant du tensioactif est ensuite ajoutée par « flow-focusing » pour générer des gouttes. Après la collection, l’acide acétique est ajouté pour réaliser la gélification « off-chip » (Figure 28 (c)). Dans ce cas-là, des agrégats de CaCO3 sont présents de manière non homogène dans le canal. Par conséquent, la quantité de calcium varie pour chaque microparticule, ce qui cause l’inhomogénéité en termes de la composition. Afin de régler ce problème, Utech et al utilisent le Ca-EDTA, complexe de Ca2+ de l’EDTA (éthylènediaminetétraacétique) qui est soluble dans l’eau (solubilité relativement faible) comme source de Ca2+. En pratique, le Ca-EDTA est d’abord dissous dans une solution d’alginate marqué par de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), pour être visualisé en microscopie de fluorescence. Ensuite, dans un dispositif microfluidique (Figure 29 (a)), les gouttes d’alginate/Ca-EDTA sont générées dans l’huile fluorée de carbone qui contient du tensioactif, par « flow-focusing » (Figure 29 (b)). L’acide acétique ajouté dans l’huile libère le Ca2+ du Ca-EDTA (Figure 29 (c)), conduisant à la gélification (Figure 29 (d)). Grâce à la solubilité de Ca-EDTA, la distribution de calcium est homogène dans les gouttes. Cela garantie l’uniformité de la composition ainsi que la structure interne (Figure 29 (e)).

Table des matières

Résumé
Abstract
Liste des abréviations et des symboles
Introduction
A. Bibliographie
Chapitre I. Techniques existantes de préparation de mimes de globules rouges
I.1. Technique d’émulsification
I.2. Techniques « digitales »
I.2.1. Technique utilisant un masque
I.2.2. Technique utilisant un moule
I.2.3. Technique « couche par couche »
Chapitre II. Technique de microfluidique à base de gouttes
II.1. Structure du dispositif microfluidique
II.1.1. Les puces microfluidiques
II.1.2. Les montages microfluidiques avec des capillaires et des jonctions
II.1.3. Géométrie des canaux
II.1.3.1. La géométrie « cross-flow »
II.1.3.2. La géométrie « co-flow »
II.1.3.3. La géométrie « flow-focusing »
II.2. Génération des gouttes
II.2.1. Caractérisation des flux et des microgouttes
II.2.1.1. Le nombre de Reynolds
II.2.1.2. La longueur capillaire
II.2.1.3. Le nombre capillaire
II.2.2. Régimes de génération des gouttes
II.2.2.1. Régime « squeezing »
II.2.2.2. Régime « dripping »
II.2.2.3. Régime « jetting »
Chapitre III. Choix de l’hydrogel
III.1. Définition
III.2. Composition des hydrogels
III.3. Processus de gélification
III.3.1. Réticulation chimique
III.3.2. Réticulation physique
III.3.2.1. Par le changement de température – liaisons hydrogène
III.3.2.2. Par la présence d’ions – réticulation ionique
III.4. Propriétés des hydrogels
III.5. Hydrogel d’alginate
III.5.1. Description
III.5.2. Applications de l’alginate
III.5.3. Structure de l’alginate
III.5.4. Propriétés de l’alginate
III.5.4.1. Propriétés physicochimiques
III.5.4.2. Gélification de l’alginate
Chapitre IV. Préparation de microparticules d’hydrogel d’alginate en microfluidique à base de gouttes
IV.1. Gélification ionique interne
IV.1.1. Forme active du cation X2+
IV.1.1.1. Mélange avant la génération des gouttes
IV.1.1.2. Mélange après la génération de gouttes
IV.1.2. Forme inactive du cation dans l’élément X2+Y2-
IV.2. Gélification ionique externe
IV.2.1. Cation X2+ introduit lors de la génération des gouttes
IV.2.1. Cation X2+ introduit lors de la collecte des gouttes
IV.3. Intégration de la diffusion de solvant
IV.3.1. Diffusion dans l’acétate de méthyle
IV.3.2. Diffusion dans le carbonate de diméthyle
B. Matériels et Méthodes
Chapitre I. Matériels
I.1. Matériaux chimiques
I.1.1. Composés chimiques
I.1.1.1. Alginate de sodium
I.1.1.2. Chlorure de calcium
I.1.1.3. Agarose
I.1.2. Solvants organiques
I.2. Dispositifs microfluidique à base de gouttes
I.2.1. Génération de gouttes
I.2.1.1. Pousse-seringues et seringues
I.2.1.2. Capillaires et jonctions
I.2.2. Collection de gouttes
I.2.3. Observation
I.2.3.1. Microscopes optiques
I.2.3.2. Système de « piscine »
I.2.4. Système thermostaté
Chapitre II. Méthodes
II.1. Principe de la diffusion de solvant
II.2. Caractérisation des gouttes
II.2.1. Mesure de la taille
II.2.2. Mesure de l’énergie interfaciale
II.3. Caractérisation de microparticules
II.3.1. Forme
II.3.2. Propriétés mécaniques
II.3.2.1. Mesure qualitative par micro-pince
II.3.2.2. Mesure du module de Young par Microscopie à Force Atomique (AFM)
C. Résultats et Discussions
Chapitre I. Préparation de microparticules de Na-alginate
I.1. Génération des gouttes
I.2. Contraction in situ
I.2.1. Contraction in situ des gouttes dans des capillaires de différents diamètres
I.2.1.1. Dans les capillaires de 500μm de diamètre interne
I.2.1.2. Dans les capillaires de 150μm de diamètre interne
I.2.2. Rôle de 𝒌 dans la contraction in situ des gouttes
I.2.3. Influence de 𝑸𝑻𝑶𝑻 sur la contraction in situ des gouttes
I.3. Collecte des gouttes et contraction ex situ
I.3.1. Préparation des microparticules de Na-alginate
I.3.2. Contrôle du diamètre final (𝒅𝒇) des microparticules de Na-alginate
I.3.3. Contrôle de la concentration finale (𝑪𝒇) des microparticules de Na-alginate
Chapitre II. Préparation de microparticules de Ca-alginate
II.1. Gélification in situ
II.1.1. Par injection du mélange de Na-alginate et de CaCl2 dans une jonction en T
II.1.2. Par le mélange de Na-alginate et CaCl2 dans une jonction en croix
II.1.3. Par le mélange de Na-alginate et CaCl2 dans une jonction en croix puis ajout de DMC dans une jonction en T
II.2. Gélification ex situ
II.2.1. Ajout de CaCl2 lors de la collection
II.2.1.1. Collection dans une solution aqueuse de CaCl2
II.2.1.2. Collection dans un mélange de DMC/CaCl2
II.2.2. Gélification des microparticules après leur collection et leur séchage
Chapitre III. Caractérisation des microparticules
III.1. Forme des microparticules
III.2. Structure interne des microparticules
III.2.1. Méthodes développées pour « couper » les microparticules
III.2.2. Observation des microparticules « coupées » de Na-alginate et de Ca-alginate
III.2.3. Mécanisme de la formation des pores à l’intérieur des microparticules
III.2.3.1. Migration des chaînes de polymères
III.2.3.2. Mobilité des chaînes polymères
III.3. Propriétés mécaniques
III.3.1. Mesure qualitative par micro-pince
III.3.1.1. Calibration
III.3.1.2. Mesures sur les microparticules
III.3.2. Mesure quantitative par la microscopie à force atomique (AFM)
Chapitre IV. Mesures ultrasonores
IV.1. Technique de diffusion ultrasonore
IV.2. Diffusion ultrasonore sur des microparticules
IV.2.1. Essais préliminaires sur des microparticules de polystyrène (PS)
IV.2.2. Mesure de la rétrodiffusion sur les microparticules de Ca-alginate
Chapitre V. Méthodes alternatives
V.1. Variation de la phase continue
V.1.1. Solvants organiques : octan-1-ol et carbonate de diéthyle
V.1.1.1. Contraction in situ lors de la génération des gouttes
V.1.1.2. Contraction ex situ lors de la collecte des microparticules
V.1.2. Mélange DMC/éthanol
V.1.2.1. Forme des microparticules collectées
V.1.2.2. Taille des microparticules collectées
V.2. Variation de l’hydrogel : l’agarose
V.2.1. Détermination du point de gélification de l’agarose
V.2.2. Préparation des microparticules d’agarose
V.2.2.1. Gélification de l’agarose dans le capillaire
V.2.2.2. Collecte et observation des microparticules d’agarose
D. Conclusion générale et Perspectives
Références
ANNEXES
Annexe 1. Production industrielle de l’alginate
Annexe 2. Matériaux pour la fabrication des dispositifs microfluidiques
Annexe 3. Découpage d’une résine encapsulant des microparticules
3.1. Encapsulation des microparticules dans la résine
3.2. Découpe de la résine avec une scie à fil
Annexe 4. « Hachage » des microparticules avec un rasoir
Annexe 5. Traitement des données AFM pour la mesure du module de Young
Annexe 6. Publication dans « Chemical Engineering Science »

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