Mécanismes de régulation d’EFA6

EFA6 régule l’activation d’Arf1 et d’Arf6 par une boucle de rétrocontrôle négatif

 Les membres de la famille des facteurs d’échange à domaine Sec7, EFA6, BRAG et Cytohésine possèdent des domaines N-terminaux divergents mais partagent une organisation commune. En effet ils sont composés d’un domaine Sec7 qui stimule l’échange GDP/GTP, suivi d’un domaine PH capable de lier les phospholipides membranaires et de réguler différentes fonctions. Dans cet article en collaboration avec l’équipe du Dr Jacqueline Cherfils, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de régulation du facteur d’échange EFA6 par son domaine PH-C-terminal. Pour cela des expériences reconstituant l’activité d’échange GDP/GTP d’EFA6 sur les protéines Arfs ont été réalisées sur des membranes. L’activité d’échange du domaine Sec7 d’EFA6 seul ou combiné à son domaine PH-C-terminal sur les protéines Arf6 myristilées ou non ou ne possédant pas l’hélice α en N-terminal (Δ13Arf6) a été mesurée par la technique de fluorescence du tryptophane. En effet, le tryptophane est un des acides aminés aromatiques composant les protéines et contribuant à la fluorescence intrinsèque de ces dernières. La fluorescence du tryptophane est utilisée pour suivre le changement de conformation des protéines Arf. Sur Arf6 comme sur Arf1 deux tryptophanes ont été identifiés comme étant sensibles aux changements de conformation lors du cycle GDP/GTP et responsables d’une forte augmentation de la fluorescence intrinsèque que l’on observe. 

Mécanismes de régulation du facteur d’échange EFA6

 Comme nous avons pu le voir dans l’introduction, les récepteurs couplés aux protéines G, suite à leur activation par leur ligand spécifique vont contrôler plusieurs voies de signalisation par l’intermédiaire de leurs protéines G hétérotrimériques. Cependant, afin que cette activation et la cascade de signalisation induite ne perdurent pas dans la cellule, les RCPGs activés vont être internalisés. Une fois internalisés les récepteurs vont être emmenés au niveau de compartiments intracellulaires endosomaux. Ils vont pouvoir être ensuite soit recyclés rapidement vers la membrane plasmique à partir des endosomes précoces, soit plus tardivement à partir des endosomes de recyclage. Sous stimulation prolongée par un agoniste ces récepteurs vont être dirigés vers les lysosomes et la voie de dégradation. La signalisation de ces récepteurs est un processus finement régulé au sein de la cellule. Cette régulation fait tout d’abord intervenir une protéine kinase de la famille des GRK. Les GRKs appartiennent à la famille des Sérine/Thréonine kinases et vont phosphoryler les RCPGs suite à leur activation. Cette phosphorylation va permettre d’augmenter l’affinité de ces récepteurs avec un deuxième acteur clé de leur désensibilisation : les arrestines. Les – arrestines, qui sont ubiquitaires, ainsi recrutées vont permettre dans un premier temps le découplage entre le récepteur et les protéines G hétérotrimériques. Dans un deuxième temps les -arrestines vont permettre le couplage des récepteurs à internaliser avec la machinerie d’endocytose. En effet grâce à la libération de leur extrémité C-terminal induite par l’interaction avec les RCPGs activés, elles sont capables d’interagir avec la protéine adaptatrice AP-2 et la clathrine et ainsi permettre le recrutement des RCPGs dans les puits recouverts de clathrine. Une étude menée au laboratoire a également mis en évidence que les -arrestines, via leur domaine C-terminal, interagissent de manière simultanée avec EFA6 et Arf6-GDP suite à l’activation du récepteur 2-adrénergique. Cette interaction est dépendante du ligand et facilite l’activation d’Arf6 par EFA6. Pendant la dernière partie de ma thèse je me suis donc intéressée à la régulation des interactions protéine-protéine dans ce complexe à trois partenaires que sont EFA6, Arf6 et la 122 -arrestine afin de mieux comprendre le rôle d’EFA6 et d’Arf6 dans le processus d’internalisation