Télécharger le fichier original (Mémoire de fin d’études)
Préparation de l’échantillon
Le plasma a été déprotéiné avant l’analyse par CLHP/SM. Des échantillons de plasma, d’étalonnage ou de contrôle de la qualité du sujet (0,25 ml) ont été pipetés dans une plaque en polypropylène à 96 puits (2,2 ml). Un mélange d’étalons internes (120 µl, composé 2,4 ng de RS-d3-EDDP (1,2 ng de chaque énantiomère) et 12 ng de RS-d9-méthadone (6 ng de chaque énantiomère) dans 0,4 M de ZnSO4, préparé quotidiennement à partir d’une solution concentrée) a été ajouté à chaque échantillon. Les échantillons ont été vortexés pendant 5 min, la plaque a été placée à 4 ° C pendant 10 min, puis 480 µl de méthanol froid (-18 °C) ont été ajoutés à chaque échantillon. La plaque a été vortexée à nouveau pendant 5 min et centrifugée à 12 000 tr / min pendant 15 min pour sédimenter les protéines. Le surnageant a été retiré et évaporé à sec à 65 ° C sous azote. Les échantillons étaient reconstitués avec 325 µl de formiate d’ammonium 20 mM (ajusté à pH 5,7 avec de l’acide formique).
Conditions chromatographiques
Le système comprenait une CLHP Agilent (Palo Alto, CA) série 1100 avec deux pompes à solvant binaires série 1100 (une pour le chargement et le lavage des échantillons, l’autre pour la séparation chirale), un échantillonneur automatique à plaques à 96 puits avec une boucle d’injection de 500 µl et une vanne de commutation à six orifices. Une colonne de garde Metaguard Polaris C8-A (12,0 mm × 2,0 mm, 5 µm) (Varian, Torrance, CA) a été utilisée comme colonne d’extraction séparation chirale de la méthadone et de l’EDDP a été réalisée en utilisant une colonne analytique Chiral-AGP (100 mm x 2,0 mm, 5 µm) avec une colonne de garde Chiral AGP (12 mm x 2,0 mm) (Chrom Tech Ltd., Cheshire, Royaume-Uni). La phase mobile était constituée d’un mélange de formiate d’ammonium 20 mM (pH 5,7): méthanol (9: 1, v/v). Le débit est fixé à 5 ml/min. Le détecteur est constitué d’un spectromètre de masse Agilent série 1100 en mode d’ionisation par electronébulisation positive. Les paramètres étaient les suivants: gaz de séchage à l’azote à 10 L / min et 350 ° C, pression du nébuliseur 206,7 kPa, tension capillaire 3 500 V et fragmentation 70 V.
Extraction en phase solide chirale suivie d’un dosage par CLHP/SM/SM
Certains auteurs comme BEQQALI & ABDEL-REHIM, 2016 ont étudié le dosage de la méthadone dans le plasma humain à l’aide de la chromatographie en phase liquide – spectrométrie de masse en tandem . Ainsi que BOUQUIE et al. (2014) ont aussi mené une étude portant sur l’extraction en phase solide chirale en ligne couplée à un dosage par spectrométrie de masse en tandem et par chromatographie en phase liquide pour la quantification des énantiomères (R) et (S) de la méthadone et de son principal métabolite EDDP dans le plasma. Dosage de la méthadone dans le plasma et la salive
Par Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM)
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour doser la méthadone dans la salive. EZODDIN et al. (2019) ont étudié une méthode portant sur la mise en forme ultrasonique de la microextraction par gouttes organiques supramoléculaires pour préconcentration de la méthadone dans des échantillons de plasma humain et de salive en utilisant la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie 34 de masse. AHMADI et al. (2012) ont aussi développé une méthode portant sur la conception assistée par ordinateur d’un polymère à empreinte moléculaire pour l’extraction sélective de la méthadone dans le plasma et la salive par chromatographie en phase gazeuse. AHMADI et al. (212) ont utilisé un chromatographe en phase gazeuse Varian CP-3800 équipé d’un injecteur automatique et d’un système de détecteur à ionisation de flamme (FID). Une colonne capillaire en silice fondue (CP-Sil 5 CB) de 30 m × 0,25 mm ID et 0,25µm d’épaisseur de film fournie par Varian (colonne capillaire Chrom Pack n ° CP8752) a été utilisée avec de l’hélium comme gaz vecteur à pression constante de 6,894 × 104 Pa. La détermination de la méthadone a été effectuée dans les conditions de température programmées suivantes: température du détecteur, 290 ° C; injection sans division (1,0 µl) à 290 ° C; la température initiale du four était de 80 ° C pendant 1,0 min, puis augmentée à 290 ° C à 40 ° C min-1, et maintenue pendant 5,0 min.
Par CLHP/SM
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour doser la méthadone dans le plasma et la salive. C’est l’exemple de GEORGE et al. (2015) qui ont développé une méthode de dosage des énantiomères de la méthadone dans le plasma et la salive humain par CLHP/SM.
Protocole
Préparation des solutions standards.
Le mélange racémique de méthadone (100 µg / mL) a été stocké à -70 ° C. Les étalons ont été préparés à la fois dans du plasma à blanc et dans de la salive à partir de la solution de stockage dans une plage de concentrations allant de 0,05 à 1 000 µg / L et stockés à -20 ° C. Ce test a été utilisé dans une large gamme analytique pour englober à la fois les doses plus faibles administrées pour le soulagement de la douleur chez les patients cancéreux et les doses plus élevées administrées aux patients sous méthadone-entretien, ainsi que les concentrations plasmatiques et salivaires subséquentes. À partir de la solution mère de l’étalon interne de 100 µg / mL, une solution de travail a été préparée dans de l’acétonitrile à 125 µg / L et stockée à -70 ° C. Les échantillons de contrôle de qualité ont été préparés à des concentrations de 0,1, 10, 500 et 900 µg / L pour chaque analyte dans le plasma et la salive et stockés à -20 ° C.
Préparation des échantillons
Extraction de la méthadone R et S à partir d’échantillons de plasma La préparation d’échantillons impliquait une simple précipitation de protéines. A 200 µL d’échantillon (standard, contrôle ou inconnu), 600 µL de solution de travail (125 µg / L dans l’acétonitrile) ont été ajoutés et mélangés au vortex pendant 30 s, suivie d’une centrifugation à 12 000 × g pendant 8 min. Le surnageant a été transféré dans des tubes de culture en verre de 12 ml respectifs et évaporé à sec à 40 ° C sous un courant d’azote gazeux. Les échantillons ont été reconstitués dans 100 µL de phase mobile, mélangés l’agitateur Vortex pendant 30 secondes et 10 µL ont été injectés à partir des flacons de l’échantillonneur automatique.
Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR LA PHARMACODEPENDANCE ET LA METHADONE
Généralités sur la pharmacodépendance
Définitions
usage
Abus
Dépendance
Addiction
Produits psychoactifs
Physiopathologie de la dépendance
Circuit de la récompense
Médiation de l’hyperdopaminergie par de nombreux neurotransmetteurs
Traitement
Traitement psychologique
Traitement pharmacologique
Généralités sur la méthadone
Historique
Structure et propriétés physicochimiques de la méthadone
Pharmacologie
Pharmacocinétique
Pharmacodynamie
Toxicologie
DEUXIEME PARTIE : METHODES DE DOSAGE DE LA METHADONE DANS DIFFERENTES MATRICES
OBJECTIFS
Objectif général
Objectifs spécifiques
METHODOLOGIE
Résultats
Dosage de la méthadone dans les matières premières
Dosage de la méthadone dans les formes pharmaceutiques
Dosage de la méthadone dans les comprimés
Dosage de la méthadone dans les formes injectables
Dosage de la méthadone dans les sirops
Dosage de la méthadone dans les milieux biologiques
Méthodes de dosage dans le plasma
III.3.1.1 Par CLHP couplée à un détecteur UV/Visibe (CLHP/UV)
III.3.1.2 Par CLHP couplée à la spectrométrie de masse (CLHP/SM)
III.3.1.3 Extraction en phase solide chirale suivie d’un dosage par CLHP/SM/SM
Dosage de la méthadone dans le plasma et la salive
III.3.2.1 Par Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM)
III.3.2.2 Par CLHP/SM
Dosage de la méthadone à travers le placenta humain par CLHP/UV 37
Dosage de la méthadone dans l’urine
III.3.4.1 Méthodes chromatographiques
III.3.4.1.1 Par CPG/SM
III.3.4.1.2 Microextraction suivi du dosage par CPG/SM
III.3.4.2 Méthode immuno-enzymatique : Dosage de l’EDDP urinaire (métabolite de la méthadone) par une méthode CEDIA®
Dosage de la méthadone dans le cerveau humain
III.3.5.1 Méthode immuno-histochimique
COMMENTAIRES. Erreur ! Signet non défini
CONCLUSION
REFERENCES BIBILIOGRAPHIQUES
