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Protocole de la détection des produits PCR par l’ELISA
Sensibilisation des microplaques à la streptavidine
Une solution à la concentration de 1µg/ml, est préparée par dilution de la streptavidine dans le tampon de coating (35mM de NaHCO3 ; 15mM de Na2CO3 ; pH 9,6). Dans chaque puits de microplaques Maxisorp®, 100µl de cette solution sont introduit (Nutman et al, 1994). Les microplaques sont agitées et incubées à température de 37°C pendant 2 heures ou laissées en chambre froide jusqu’au lendemain, puis le contenu des puits est vidé. Les microplaques ainsi sensibilisées, peuvent être conservées à 4°C pendant quelques semaines, pour les manipulations ultérieures.
Préparation des solutions de travail
Avant de commencer la détection des produits PCR, les solutions de travail sont préalablement préparées à partir du kit PCR-ELISA Dig-Detection, 5pack.
– La solution d’hybridation se prépare à partir du tampon d’hybridation et de la sonde biotinylée olicongo à la concentration de 7,5 pmol/ml, soit 61,41 ng/ml.
– La solution des anticorps Anti-DIG-POD : les anticorps anti digoxygénine (Anti-DIG-POD) lyophilisés sont d’abord reconstitués dans 250 µl d’eau bidistillée dans un tube. Cette solution de reconstitution sans être agitée, est laissée à la température ambiante pendant 15 mn. La solution de travail est ensuite préparée par dilution au centième de la solution de reconstitution avec le tampon de dilution du conjugué.
– La solution de lavage s’obtient par dissolution d’un comprimé du tampon de lavage dans 2 litres d’eau bidistillée.
Détection des produits PCR marqués à la DIG-dUTP
La détection des produits PCR se fait selon un protocole analogue à celui de la technique ELISA. Cette opération de détection se déroule selon les 7 étapes suivantes :
1) Pour chaque échantillon, on prévoit 2 puits de la microplaque sensibilisée à la streptavidine. Dans un tube de 250µl stérile, on y introduit 5 µl des produits PCR,
20µl de solution de dénaturation (NaOH à 1N). Le tube est vortexé, brièvement centrifugé et laissé pendant 10 minutes à la température ambiante. On complète ensuite à 250µl avec la solution d’hybridation et on vortexe à nouveau avant de repartir dans les puits.
2) On pipette dans chaque puits, 100µl du mélange précédemment préparé. On incube sous agitation la microplaque à 37°C pendant 1 heures 30 minutes.
3) On aspire le contenu des puits de la microplaque, puis les puits sont lavés 3 à 6 fois avec la solution de lavage. Après le dernier lavage, les microplaque sont légèrement tapotées sur un linge sec stérile afin d’absorber tout le liquide de lavage.
4) On ajoute alors, 100µl de la solution d’anticorps anti-DIG-POD dans chaque puits. On incube également sous agitation, à 37°C pendant 30 minutes.
5) On verse le contenu des puits et on les lave à nouveau comme en 3).
6) On introduit 100µl du substrat (ABTS®) dans chaque puits, puis on réalise une dernière incubation avec agitation à 37°C pendant 10 minutes à l’abri de la lumière.
7) La lecture de la microplaque se fait à 405 nm au spectrophotomètre.
Résultats et Discussions
Résultats
Au cours de cette étude, les analyses ont consisté à la détection de T. congolense type savane dans 334 échantillons de buffy coats bovins de terrain. Les échantillons sont subdivisés en deux lots : le premier lot totalise 257 échantillons provenant de la région de Ouangolodougou et le second lot composé de 77 échantillons, est issu d’un stock de prélèvements de 2002 du nord Ghana. Les échantillons après amplification par PCR sont analysés par migration sur gel agarose et par détection par la méthode ELISA. Pour les échantillons de Ouangolodougou, des analyses de parasitologie par la méthode de Murray, ont été réalisées par l’équipe de terrain lors des sorties de prélèvements.
Mise au point de la PCR-ELISA
Pour la mise au point de la PCR-ELISA, de l’ADN pur de 6 souches de T. congolense type savane et quelques échantillons de terrain ont été analysés par la PCR classique et la PCR-ELISA. La PCR-ELISA a détecté avec succès, toutes les 6 souches de T. congolense type savane (figure 5).
Figure 5 Détection des ADN purs des 6 souches de Trypanosoma congolense type savane A= Blanc, B= Négatif, C=ILRAD/776, D=Sat.91.2 E=IL3575, F=IL3000, G=Sam.32.1, H=Kar.83.
De même, pour les échantillons de terrain, les résultats de la PCR-ELISA concordent avec les résultats obtenus par PCR classique (Figures 6 et 7 ). C’est alors que, la PCR-ELISA a été appliquée pour analyser les 334 échantillons de terrain dans cette étude.
Table des matières
Introduction générale
Chapitre I. Généralités sur les trypanosomes
1.1. Pathologie de la trypanosomose animale
1.1.1. Symptômes de la trypanosomose animale
1.2. Techniques de diagnostic de la trypanosomose
1.2.1. Techniques directes
1.2.2. Techniques indirectes
Chapitre II. Matériel et méthodes
2.1. Matériel
2.1.1. Sites géographiques et échantillons
2.1.2. Le matériel biologique
2.1.2.1. Les souches de trypanosomes témoins
2.1.2.2. Les nucléotides ou les dNTP
2.1.2.3. Les oligonucléotides
2.1.2.4. La Taq polymérase
2.1.2.5. L’anti digoxigénine conjugué à la peroxydase
2.1.2.6. La streptavidine
2.1.3. Matériel de laboratoire
2.1.3.1. Le matériel d’amplification par PCR
2.1.3.2. Le matériel de détection par ELISA
2.2. Méthodes
2.2.1. PCR
2.2.1.1. Principe de la PCR
2.2.1.2. Protocole d’amplification de la PCR-ELISA : marquage à la DIG- dUTP
2.2.1.3. Détection des produits PCR sur gel d’agarose
2.2.2. PCR-ELISA
2.2.2.1. Les principales méthodes de révélation utilisées en PCR-ELISA
2.2.2.2. Protocole de la détection des produits PCR par l’ELISA
2.2.2.2.1. Sensibilisation des microplaques à la streptavidine
2.2.2.2.2. Préparation des solutions de travail
2.2.2.2.4. Détection des produits PCR marqués à la DIG-dUTP
Chapitre III. Résultats et Discussions
3.1. Résultats
3.1.1. Mise au point de la PCR-ELISA
3.1.2. Validation de la PCR-ELISA
Tableau IV. Densités optiques des échantillons analysés par PCR-ELISA
3.1.3. Résultats de la PCR
3.2. Discussion
3.2.1 Avantages de la PCR-ELISA
3.2.2. Analyse comparative de la PCR Classique et de la PCR-ELISA
3.2.3. Limites de la PCR-ELISA
Conclusion générale
Bibliographie
