TEST FOR THE DETECTION OF ANTIMICROBIAL
RESIDUES

Contexte

Les animaux d’élevage peuvent être traités avec des antibiotiques, soit de façon préventive, soit de façon curative. Donc des résidus d’antibiotiques peuvent être retrouvés dans le muscle de ces animaux, soit sous la forme de la molécule mère, soit sous une forme métabolisée. Dans ce cadre, des Limites Maximales de Résidus (LMR) ont été fixées pour tous les antibiotiques autorisés. Les méthodes de dépistage qui sont la première étape du contrôle doivent permettre de détecter ces antibiotiques en dessous ou au moins au niveau de ces LMR. Le kit commercial appelé Premi®Test (commercialisé initialement par la société DSM, Pays-Bas) permet une détection large spectre de plusieurs grandes familles d’antibiotiques, dans le muscle de différentes espèces animales. Ce test microbiologique est basé sur la détection de l’inhibition de la croissance d’une souche bactérienne (Bacillus stearothermophilus) pré-ensemencée dans un milieu gélosé prêt à l’emploi. La détection de l’inhibition de la croissance bactérienne en présence de résidus d’antibiotiques dans l’échantillon se fait par un changement de couleur, liée à la présence d’un indicateur de pH, en moins de 4 heures. En effet, cette souche bactérienne possède la propriété d’acidifier le milieu quand elle se développe. En 2008, la société DSM a déposé un dossier de certification AFNOR. En tant que laboratoire expert, nous avons réalisé les études de validation et présenté les résultats au Bureau Technique agroalimentaire de l’AFNOR

Méthodologie/Principaux résultats

La validation selon le référentiel AFNOR, spécifique des kits de dépistage des résidus d’antibiotiques, est constituée de deux étapes μ l’étude préliminaire et l’étude collaborative. L’un des grands principes de l’étude préliminaire est la comparaison d’une méthode alternative (le kit commercial) avec une méthode de référence. Toute l’étude préliminaire est réalisée avec les 2 méthodes en parallèle ; par contre, l’étude collaborative ne nécessite la pratique des 2 méthodes que chez le laboratoire expert, alors que les laboratoires participants réalisent seulement les analyses avec la méthode alternative. Dans le domaine du dépistage des résidus d’antibiotiques, la méthode de référence est en principe la méthode officielle utilisée pour la réalisation des plans de contrôle et plans de surveillance français. En effet, il n’existe pas de méthodes normalisées dans ce domaine, contrairement au domaine de la microbiologie alimentaire. Dans le cas du Premi®Test, la méthode officielle française, appelée Méthode des 4 Boites (M4B), a été choisie comme méthode de référence. La comparaison s’avérait complexe étant donné que les 2 méthodes divergeaient en de nombreux points : – La préparation des échantillons de muscle est très différente. En effet, pour la M4B, des carottes sont prélevées dans des muscles entiers (non broyés) et congelés. Puis, des rondelles d’une épaisseur de 2 mm sont découpées dans ces carottes et déposées sur les boites de milieu gélosé préalablement ensemencé. Dans le cas du Premi®Test, les muscles doivent être entiers, puis pressés pour en obtenir le jus. Ensuite, le jus est déposé sur les ampoules de Premi®Test contenant le milieu gélosé pré-ensemencé. Le spectre de détection des 2 méthodes est différent. En effet, la M4B a un spectre plus large que la méthode alternative, puisque plusieurs germes sont ensemencés dans 140 différents milieux pour la M4B. alors qu’un seul germe ensemencé dans un seul milieu est utilisé dans la méthode alternative. – Un problème méthodologique se posait donc pour la supplémentation des muscles. En effet, pour déterminer les limites de détection des méthodes, les matrices sont usuellement supplémentées, avec des quantités connues d’antibiotiques. Dans le cas de la M4B, il est impossible de supplémenter des muscles intacts puisque l’homogénéité de la répartition ne peut pas être garantie. De même, dans le cas du kit, supplémenter du muscle intact puis récupérer le jus ne constituait pas un protocole fiable. De plus, pour déterminer les limites de détection des 2 méthodes, il faut tester de nombreux antibiotiques, chacun à 3 concentrations. Il est impossible de trouver les matériaux naturellement chargés (non broyés), contenant les antibiotiques qui nous intéressent, et de surcroit à 3 concentrations différentes. C’est pourquoi cette étude préliminaire a été décomposée en 3 étapes (Figure 46). Suite à l’étude préliminaire, une étude collaborative impliquant la participation de 10 laboratoires, a été organisée. Des échantillons de jus de viande supplémentés ont été envoyés aux participants, puis analysés. Chaque matériau a été préparé, codifié et envoyé en double aveugle, soit 32 échantillons à analysés par laboratoire. En plus des échantillons, l’Anses a préparé et fourni à tous les laboratoires collaborateurs 3 témoins négatifs (porc, bœuf, poulet) et un témoin positif bœuf (contenant de la pénicilline G à 10 µg/kg). Les laboratoires participants devaient réaliser les analyses en double aveugle (2 séries distinctes d’analyses). L’étape 1 a permis de déterminer les limites de détection du Premi®Test pour 6 molécules de 5 familles différentes d’antibiotiques à partir de jus de viande de porc supplémentés. Excepté pour la gentamicine, les limites de détection du Premi®Test se situent au niveau des Limites Maximales de Résidus (LMR). Ces résultats sont en accord avec les performances du test annoncées par le fabricant. L’étape 2 a permis de déterminer un taux de faux-positifs et un taux de faux-négatifs de 0% pour le Premi®Test. Les taux de faux-négatifs et de faux-positifs étaient meilleurs pour le Premi®Test (0%) que pour la M4B (57% et 15% respectivement). En effet, les limites de détection de la M4B sont insuffisantes pour certains antibiotiques (eg. aminosides). De plus, cette phase de l’étude a montré que la M4B et le Premi®Test donnent des résultats concordants (« les 2 méthodes ne sont pas différentes »). L’étape 3 a permis de montrer que le Premi®Test était applicable aux muscles de différentes espèces animales (porcins, bovins, volaille, ovin, lapin, …). La comparaison entre le Premi®Test et la M4B réalisée sur les seuls échantillons analysés au niveau de l’Anses a fait apparaître une différence entre les 2 méthodes. Toutefois, l’intégration des résultats négatifs dans les LVD permet de constater que les 2 méthodes ne sont pas différentes. La capacité de chaque test à détecter les différentes familles d’antibiotiques a été étudiée. Le Premi®Test détecte mieux les antibiotiques de certaines familles (eg. béta-lactamines) que la M4B et moins bien certaines comme les tétracyclines.  Les résultats des laboratoires participants ont été analysés afin de déterminer différents paramètres de validation. Le référentiel AFNOR n’indique pas de limites minimales à atteindre pour les caractéristiques de performance déterminées. La spécificité et la sensibilité au niveau L3 ont été déterminées respectivement à 95,3 % et 72,5 %. La sensibilité au niveau L3 est de 100 % pour la sufaméthazine à 400 µg/kg (4*LMR) dans le muscle de bovin et pour la tylosine à 200 µg/kg (2*LMR) dans le muscle de poulet. Elle est diminuée par un taux de faux-négatifs plus élevé pour le ceftiofur à 800 µg/kg (0,8*LMR) et l’oxytétracycline à 400 µg/kg (4*LMR) dans le muscle de porc. Ces résultats sont satisfaisants en regard des résultats obtenus lors de l’étude préliminaire. Les capacités de détection obtenues lors de l’étude préliminaire (étape 1) par le laboratoire expert étaient plus basses (sufaméthazine à 2*LMR, tylosine à la LMR, ceftiofur à 0,5*LMR et oxytétracycline à 2*LMR). C’est logique car les résultats d’un seul laboratoire, de surcroît expert dans ce genre de validation, sont le plus souvent meilleurs que les résultats globaux d’une étude collaborative, impliquant des participants plus ou moins habitués à utiliser la méthode alternative. Les résultats des laboratoires participants en termes de répétabilité et de reproductibilité étaient très satisfaisants, avec respectivement un pourcentage moyen de 94,8% pour un même échantillon et de 92,7 % pour 2 échantillons identiques (paire) en répétabilité et un pourcentage moyen de 89,1 en reproductibilité.