PARTIE BIOLOGIE

Activités biologiques des extraits totaux des feuilles de RKVJD/H1

Test de toxicité aigüe 

L’innocuité d’un produit destiné à l’alimentation ou candidat à être un médicament est une propriété incontournable car garantit la sécurité de son utilisateur. (LAPOINTE G., 2004) L’exposition d’un organisme à un produit, à court ou à long terme, peut provoquer une toxicité aigüe ou chronique. Ainsi, avant toute étude sur les activités biologiques d’un produit, évaluer sa toxicité s’avère indispensable. Cette démarche a été appliquée dans le présent travail aux extraits de feuilles de RKVJD/H1 à utiliser comme bain de bouche. Dans le test de toxicité aiguë, les modèles pharmacologiques utilisés étaient des souris mâles de race SWISS, au nombre de 12, âgées de 4 semaines environ, et pesant entre 19,5 et 32 grs.
Un des objectifs de l’expérience a été de voir l’effet sédatif des extraits étudiés. Le protocole d’ELHAJILI et coll. en 2009 a été appliqué. Les souris ont été élevées dans le cyclenormal de lumière et d’obscurité, et acclimatées à la température du laboratoire pendant 10 jours.
Avant l’évaluation de la toxicité aigüe, les animaux ont été mis à jeun pendant 12 heures, toutefois avec un accès libre à l’eau. Au bout de ce temps, les souris ont été réparties, en nombre égal, en 4 lots dont 1 témoin (groupe N°1). Pour identifier les animaux, et les repérer dans les lots, des colorations de différentes parties de leurs corps ont été effectuées (codes couleurs). Les animaux du groupe N°1 ont reçu chacun 10 ml /Kg d’eau distillée. Pour les animaux restants, les doses de 0,5 ; 1 et 2 g/ Kg dissouts dans un volume d’eau distillée de 10ml / Kg, ont été administrées, respectivement aux souris des groupes N° 2, 3 et 4 (HOUBO. D.R.A.D. et coll., 2001). . Pour l’expérience, des cuvettes en plastique avec des carreaux de 5cmx5cm dessinés sur leurs fonds selon la méthode de VAGHASIA. Y. K. et coll. en 2010, (Schéma 6.) ont été utilisées. Les animaux ont été observés pendant 24 heures. Leurs changements de comportement ainsi que les signes des effets toxiques du produit, rapportés sur le tableau 8 étaient à observer notamment pendant les 30 premières minutes après l’administration.

Test d’activité cicatrisante 

L’épithélium de la cavité buccale présente parfois des plaies d’origine traumatique ou infectieuse. La cicatrisation spontanée de ces blessures est souvent difficile. Dans ces derniers cas, des produits adaptés sont nécessaires : antibiotiques, cicatrisants. Traditionnellement, la décoction des feuilles de RKVJD/H1 est utilisée, entre autres, dans le traitement des « vava masaka » ou aphtes. Il s’agit de lésions inflammatoires (ou ulcérations) douloureuses de la muqueuse buccale, (WAINSTEN J.P., 2009). Ainsi, vérifier scientifiquement cette vertu a été à faire : un test d’activité cicatrisante ont été réalisés dans le présent travail.
Les modèles pharmacologiques étaient des rats de souche WISTAR au nombre de 9, pesant entre 180 et 230 grs, et âgés de 6 mois environ.
Les animaux ont été répartis en 3 lots : N° 1 témoins ; N°2 traités avec le produit à base des extraits de feuilles de RKVJD/H1, N° 3 lot d’animaux en réserves.
La pommade à tester, comme tout produit fini, comporte 4 constituants (Tableau 9).

Test s d’activités antimicrobienne et antifongique 

La méthode de diffusion en milieu gélosé (antibiogramme), appliquée aussi par MOURAD B. en 2011 a été mise à profit.

Choix des souches utilisées 

Dans le cas des extraits RKVJD/H1, toutes les souches à notre disposition, incluant celles caractéristiques de la flore buccale (GUILLAUME G. et coll., 2011) ont été utilisées. Etant donné que les feuilles de RKVJD/H1 sont aussi employées empiriquement pour traiter d’autres maladies, avoir le plus d’informations sur les activités antimicrobiennes du produit testé était une opportunité à saisir.

Test d’activité antioxydante 

Les extraits totaux des feuilles de RKVJD/H1 et leurs fractions AcOEt, et n-BuOH ont été sélectionnées pour le test. La CCM dans le système cellulose/BAW 4/1/5/ (V/V/V) a été mise à profit.
Une pulvérisation du chromatogramme par une solution méthanolique de DPPH à raison 6mg pour 3 ml a été effectuée Le test est positif en cas de changement de coloration des taches en jaune, sur un fond violet.

Formulation et conservati on du bain de bouche à base des extraits totaux de feuilles de RKVJD/H1

Si jusqu’à cette étape, les extraits hydroalcooliques ont été utilisés pour démontrer des activités présumées des feuilles de RKVJD/H1, dans cette partie du travail la décoction a été retenue pour la formulation du bain de bouche. Plusieurs raisons ont motivé ce choix :
-la préparation doit être la plus proche possible de la méthode empirique ; toutefois, en se souciant de sa conservation ;
-pour faciliter l’emploi du bain de bouche, la standardisation étant incontournable.

PARTIE CHIMIE 

Obtention et caractérisation des extraits totaux des feuilles de RKVJD/H1 

Traditionnellement, l’infusion et la décoction sont des formes courantes d’extraits des plantes utilisées pour traiter des maladies : l’eau est donc le solvant utilisé dans deux cas.
Le solvant d’extraction employé pour l’étude, a été le mélange EtOH/H20 30/70 V/V : (l’éthanol étant à 90°). La quantité d’eau est importante, donc proche du solvant d’extraction empirique. D’autres auteurs ont aussi utilisé le même mélange de solvants pour obtenir des extraits pour la formulation de phytomédicaments (SAKINE M.N.A., 2013).
La macération à température ambiante utilisée dans ce travail est une méthode non destructive pour obtenir les molécules bioactives dans leurs structures originelles.
La lyophilisation a été nécessaire, car permettant d’éliminer toute trace d’eau qui pourrait dégrader l’extrait.

Criblage des flavonoïdes dans les extraits totaux de RKVJD/H1 

Les flavonoïdes sont des composés qui donnent des colorations caractéristiques à des fleurs, fruits et feuilles des plantes des Angiospermes et Gymnospermes. Si les couleurs de ces parties ne sont pas directement visibles, les flavonoïdes contribuent à leur coloration en tant que co-pigments. Dans ce cas, ils jouent le rôle de protecteurs des anthocyanes, généralement colorés en rouge, bleu, ou violet (BRUNETON.J., 1993).

Résultats du criblage phytochimique 

Criblage phytochimique des flavonoïdes dans les extraits hydro-alcooliques

totaux de RKVJD/H1 selon les techniques de FONG et coll. 1977 : Les résultats des tests, ainsi que leurs interprétations selon les informations de FONG et coll. en 1977, sont portés dans le tableau 15. Les squelettes de base des classes structurales des composés détectés y sont rapportés.

Résultats du test à la gélatine et à la gélatine salée 

Former des complexes avec des protéines, telle la gélatine, est une des propriétés communes aux deux classes de tannins : hydrolysables et non hydrolysables (CHEYNIER V. et coll., 2006) Dans le test, à la première addition de la solution saline (NaCl 10%) à la solution aqueuse de l’extrait étudié (tube N° 1), on n’observait aucun changement. Il en est de même à l’addition de solution de gélatine 1% au tube N° 2. Cependant après ajout au tube N° 3 d’un mélange (V/V) de solution de gélatine 1% et de NaCl 10%, une floculation est observée : ce phénomène est dû probablement à la présence de tannins.
-Si dans le tube 2 aucune floculation n’a été observée, ce résultat pourrait provenir de la forte dilution de la solution aqueuse. Le NaCl joue le rôle de « relargage », c’est-à-dire qu’il isole le solvant, augmentant ainsi la concentration du complexe tannins-gélatine rendant ce dernier plus visible.

Résultats du test au FeCl3 

Il s’agit, d’après FONG et coll. en 1977 un autre test pour démontrer la présence de tannins, qui donnent une coloration bleu, bleu-noir, vert ou bleu-vert. Dans notre cas, le bleu noir a été la couleur observée. Donc l’extrait RKVJD/H1 contient effectivement de tannins.
Le Flavanol est l’élément structural de base des polymères appelés tanins condensés (ou proanthocyanidols condensés). Comme tous les composés phénoliques, ils forment des complexes colorés, tels avec FeCl3. Selon ROBERTS J et coll 1977, il se formerait des phénates ferriques qui absorbent dans le visible. L’expérience suivant montre le phénomène.

Remarque 

Lors du test de BATE SMITH, utilisant HCl à chaud, lorsqu’on prolongeait le temps de la réaction la couleur rouge devient de plus en plus foncée. Dans les cas présent, étant donné la présence de tanins condensés dans les extraits analysés, et qui réagissent normalement avec HCl à chaud, ces tanins pourraient intervenir dans l’intensification de la couleur rouge. Pour illustrer et comprendre le mécanisme, l’exemple du cas d’un dimère de tanin catéchique a été retenu. Toutefois, le tableau 18 rappelle les structures de base à considérer.

Cas des fractions n-BuOH 

Analyse qualitative 

A l’examen du chromatogramme C4, on note des taches violet-noires qui gardent la même couleur avant et après traitement par des vapeurs de NH3. Les composés témoins, qui sont des flavonoïdes, ont les mêmes comportements que ceux dans la fraction n-BuOH observés : ces derniers sont donc des flavonoïdes et particulièrement des flavones de par le mode d’interprétation de MARKHAM en 1982. Ces résultats vérifient ceux du criblage phytochimique.
Par ailleurs, la présence de taches de Rf voisines de celles des deux témoins utilisés peut être interprétée comme la présence de flavonoïdes DI-GLYCOSYLES dans la fraction n-BuOH Ces résultats vérifient le fait que le n-BuOH, peut extraire des flavonoïdes plus polaires (exemple des diglycosides) que ceux pris par l’AcOEt (monoglycosides).

Analyse quantitative 

Pour diversifier l’apprentissage des techniques chromatographiques, et se familiariser à leurs mises en œuvre, le fractionnement de la fraction n-BuOH par chromatographie liquide basse pression, sur colonne de gel de sephadex LH 20 a été mis à profit. Cette méthode est généralement utilisée avec les flavonoïdes pour les séparer ou pour les purifier.
Dans le cas présent, seules les quatre premières sous fractions ont été retenues. Leurs masses respectives sont groupées dans le tableau 27.et le chromatogramme de suivi de l’expérience présenté sur le tableau 28.

Concernant les lots témoins 

-Toutes les solutions ne contenaient que des extraits totaux de feuilles de RKVJD/H1 :
 De J4 à J9, on note une forte augmentation de D.O (de 1,75 à 2,29) : le phénomène pourrait être dû au développement optimal de la colonie bactérienne. D’après (PAYETTE G., 2014) cette période correspond aux présences des conditions optimales nécessaires et indispensables au développement des microorganismes tels que ; la température, le pH, les nutriments et l’oxygène.
 De J9 à J12 : la valeur de la D.O connait une légère diminution (de 2,29 vers 2,16) : ce phénomène pourrait indiquer l’absence d’une ou des conditions indispensables cités précédemment, et notamment un épuisement de nutriments apportés par les extraits RKVJD/H1.
 Dès J 12 jusqu’à J39, la valeur de la DO augmente de façon exponentielle et peut attendre un optimum de 3,73. Cette période de redéveloppement intense correspondrait à une période où toutes les conditions du développement sont réunies. Il se pourrait que les microorganismes trouvent d’autres sources de nutriments différents de ceux épuisé. La période à laquelle la DO présentait une dépression entre J9 à J12 est appelée « la période de transition nutritionnelle » : car à l’épuisement de la première forme de nutriments les microorganismes s’adaptent aux nouvelles sources de nutriments : ceux qui ne sont pas adaptés vont mourir. Ces faits expliquent la faible diminution de la DO avant son exponentielle augmentation. Ces résultats permettent de dire que les microorganismes se présentent sous la forme de développement dite « diauxique » (PELMONT J., 1993)
 on note un plateau pour les valeurs de la DO : il y a donc un blocage de l’évolution des colonies. Puis, aucun changement n’a été relevé jusqu’à J 45 Au vu de ces résultats, on pourrait dire qu’il y avait dégradation, avec fermentation du produit dès J 4. Ainsi, la durée de vie des extraits RKVJD/H1 seul pourrait être évaluée à 4 jours

Table des matières

Remerciements
Liste des Abréviations
Liste des tableaux
Liste des Illustrations 
Liste des Schémas 
Photographie
I. INTRODUCTION 
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
 Présentation et traitements préalables
II.2. PARTIE CHIMIE
II.2.1. Préparation des extraits totaux de feuilles de RKVJD/H1
II.2.1.1. Matériels de laboratoire
II.2.1.2. Méthode d’extraction
II.2.2. Criblage des flavonoïdes et des tanins dans les extraits totaux de feuilles de RKVJD/H1
II.2.2.1. Méthodes phytochimiques
II.2.2.2. Méthodes chromatographiques
II.2.2.2.1. Concernant la CCM
 Liste des matériels pour la CCM
II.2.2.2.2. Concernant la CP préparative
II.2.2.2.3. Pour la CLBP sur Sephadex LH20
II.3. PARTIE BIOLOGIE
II.3.1. Activités biologiques des extraits totaux des feuilles de RKVJD/H1
II.3.1.1. Test de toxicité aigüe
II.3.1.2. Test d’activité cicatrisante
II.3.1.2.1 Expression des résultats
II.3.1.3 Tests d’activités antimicrobienne et antifongique
II.3.1.3.1 Choix des souches utilisées
II.3.1.3.2 Préparation des souches utilisées
II.3.1.3.3 Méthode des tests antimicrobien et antifongique
II.3.1.4. Test d’activité antioxydante
II.4 Formulation et conservation du bain de bouche à base des extraits totaux de feuilles de RKVJD/H1
II.4.1. Formulation du bain de bouche
II.4.2. Test de vieillissement
II.4.2.1. Méthode du test
II.4.2.1.1. Expression des résultats
III. RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1. RESULTATS
 Concernant le choix des feuilles de la plante RKVJD/H1
III.2. PARTIE CHIMIE
III.2.1. Obtention et caractérisation des extraits totaux des feuilles de RKVJD/H1
III.2.2. Criblage des flavonoïdes dans les extraits totaux de RKVJD/H1
III.2.2.1. Résultats du criblage phytochimique
III.2.2.1.1. Criblage phytochimique des flavonoïdes dans les extraits hydro-alcooliques totaux de RKVJD/H1 selon les techniques de FONG et coll. 1977
 Réaction de WILSTATER
 Réaction de BATE SMITH
III.2.2.1.2. Criblage phytochimique des tanins dans les extraits totaux de RKVJD/H1 selon les techniques de FONG et coll. 1977
 Résultats du test à la gélatine et à la gélatine salée
 Résultats du test au FeCl3
III.2.2.2. Résultats du criblage des flavonoïdes par des méthodes chromatographiques
III.2.2.2.1. Résultats du fractionnement des extraits totaux
III.2.2.2.2. Cas de la fraction AcOEt
 Analyse qualitative
 Analyse quantitative
III.2.2.2.3. Cas des fractions n-BuOH
 Analyse qualitative
 Analyse quantitative
III.3. PARTIE BIOLOGIE
III.3.1. Quelques propriétés biologiques des extraits totaux des feuilles de RKVJD/H1
III.3.1.1. Test de toxicité aigüe
III.3.1.2. Test d’activité cicatrisante
III.3.1.2.1. Expression et analyse des résultats du test
 Phase vasculaire
 Phase inflammatoire
 Phase de prolifération des tissus ou granulation
 Phase de ré-épithélialisation
III.3.1.3 Test d’activités antibactérienne et antifongique
III.3.1.5 Test de vieillissement
IV. CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE 
WEBOGRAPHIE