Culture embryonnaire et stratégie de transfert 

Culture embryonnaire 

Observation de la fécondation 

Entre 19 à 20 heures post insémination en FIVc, les ovocytes ont été dénudés par pipetage mécanique grâce à des capillaires de 150 µm de diamètre (stripper, JCD, Lyon, France) puis rincés et placés dans des microgouttes de nouveau milieu de 40 µl de One Step (SAGE Origio, Lyon, France) sous huile. C’est un milieu unique, apportant tous les nutriments nécessaires pour le développement embryonnaire de J1 à J6. La fécondation a été objectivée par l’observation de deux pronuclei PN (mâle et femelle) et de l’expulsion du 2ème globule polaire (GP) sous un microscope inversé (Nikon TE 300) à l’objectif x40. b) Observation embryonnaire L’observation de la morphologie embryonnaire au microscope tient une place privilégiée. C’est une méthode non invasive, simple et rapide, permettant de décider du devenir des embryons parmi les choix suivants : transfert, congélation ou arrêt de culture. Il s’agit d’une méthode subjective, opérateur et laboratoire dépendant.  Clivage précoce J1 A la 27ème heure post insémination, la présence ou non du clivage précoce a été observée sous microscope inversé (Nikon TE 300) à l’objectif x40. Globules Polaires (GP) ProNucléi (PN). (a) Stade 2PN. (b) Stade BD. (c) Clivage précoce. Les différents stades observés correspondaient soit à une persistance des pronucléi (stade 2PN), soit à leur effacement (stade BD ou break-down), soit à un clivage précoce embryonnaire. Dans ce dernier cas, le nombre de blastomères, leur régularité et le taux de fragmentation étaient notés.  

Observation embryonnaire à J2 et J3

 Les embryons ont été cultivés dans des microgouttes de 40 µl de milieu unique One Step (SAGE Origio, Lyon, France) jusqu’à J2 ou J3. La morphologie embryonnaire a été évaluée à J2 et J3 sous microscope inversé (Nikon TE 300) à l’objectif x40 en utilisant une classification basée sur : – le nombre de blastomères, – la typicité du clivage, – le pourcentage de fragments anucléés, – la présence ou non de blastomères multinucléés. Plusieurs auteurs ont décrit l’importance de certains critères dans la survenue de l’implantation. La régularité de la taille des blastomères à J2 est en relation avec une augmentation du taux de grossesse post-AMP (Hardarson et al. 2001 ; Holte et al. 2007). Un clivage aboutissant à des cellules de tailles différentes entraîne une distribution différente des molécules cytoplasmiques (protéines, ARNm…), ce qui augmente l’incidence de blastomères multinucléés et d’aneuploïdie et diminue les taux d’implantation (Hardarson et al. 2001 ; Magli et al. 2001 ; Van Royen et al. 2001 ; Scott et al. 2007). La proportion de fragments dans le volume intra-pellucidaire est largement utilisée pour prédire le potentiel d’implantation des embryons et est liée à l’aneuploïdie (Ebner et al. 2001 ; Ziebe et al, 2003 ; Munne et al. 2006). Si la fragmentation n’atteint pas 10% du volume total de l’embryon, il est convenu a b c – 34 – qu’elle n’a pas d’impact sur le potentiel de développement de l’embryon (Van Royen et al. 2001, Holte et al. 2007). La multinucléation a été décrite comme étant liée à des anomalies chromosomiques de l’embryon (Hardarson et al. 2001). Des analyses génétiques, révélant une élévation des taux d’aneuploïdie, d’anomalies chromosomiques et de défauts dans la synthèse d’ADN, sont à l’origine d’une baisse des taux de grossesse et d’implantation après leur transfert (Hardarson et al. 2003). Ces études isolées ont fini par aboutir à l’établissement d’un Consensus à l’échelle européenne (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011). Les embryons sont définis comme étant « Top » ou « Non Top » selon leurs caractéristiques morphologiques