Influence de la méthylation des éléments  transposables sur les gènes situés à proximité 

Comme  décrit  dans  l’introduction,  il  semble  qu’une  perte  importante  de  la  méthylation  de  l’ADN  au  niveau  des  séquences  répétées,  telle  celle  induite  par  une  mutation  dans  le  gène  ddm1,  n’ait  que  peu  de  conséquences  sur  la  régulation  des  gènes  (Lippman  et  al.  2004,  Vongs  et  al.  1993).  Cette  observation  est  renforcée  par  le  fait  que  le  mutant  ddm1  ne  présente  pas  d’altérations  phénotypiques  majeures  (du  moins  dans  les  premières  générations  d’autofécondation).  Cependant,  ces  informations  sont  quelque  peu  contradictoires avec les résultats d’une étude montrant que les ET méthylés semblent avoir  un effet négatif sur l’expression des gènes à proximité desquels ils sont localisés (Hollister et  al. 2011).  Afin d’analyser plus avant les conséquences de la perte de la méthylation de l’ADN au niveau  des séquences répétées, j’ai participé aux travaux initiés par le précédent étudiant en thèse,  Felipe  Teixeira,  présentés  dans  le  manuscrit  en  préparation  ci‐après.  Ma  contribution  principale  concerne  les  expériences  d’ARN‐chip  utilisant  les  puces  à  ADN  CATMA  réalisées  afin de comparer les transcriptomes des différents mutants. J’ai également généré le triple  mutant  ddm1rdr2T‐sdc  et  ai  participé  à  la  validation  des  gènes  candidats  potentiellement  contrôlés directement par la méthylation des séquences répétées situées à proximité.

The genetic dissection of DNA methylation in Arabidopsis has uncovered a complex interplay  between  DNA  methyltransferases  (MTases),  DNA  demethylases,  histone‐modifying  or  remodeling  enzymes,  RNA  interference  (RNAi)  components,  and  RNA  polymerases  [1].  Among  the  actors  identified  so  far,  the  chromatin  remodeler  DECREASE  IN  DNA  METHYLATION1  (DDM1;  [2])  stands  alone  as  a  master  regulator  of  DNA  methylation  maintenance  over  repeat  sequences  [3].  Indeed,  mutations  in  DDM1  lead  to  a  loss  of  DNA  methylation  over  most  repeat  elements  present  in  the  genome  but  not  over  genes.  Furthermore, ddm1 mutants exhibit a massive accumulation of transcripts corresponding to repeat  sequences,  but  do  not  substantially  alter  the  expression  of  neighboring  genes,  with  few  exceptions  [2,  4].  Consistent  with  these  observations,  early  generation  ddm1  mutants  exhibit  only  mild  phenotypic  alterations.  However,  severe  but  sporadic  phenotypic  alterations  are  observed  in  advanced  generations  and  result  from  the  mobilization  of  transposable  elements  (TEs)  into  or  near  genes  as  well  as  rare  late  onset  epigenetic  alteration  of  gene  expression  [5‐10].  In  contrast,  the  RNA‐dependent  DNA  methylation  (RdDM) pathway, which targets a majority of methylated repeat elements but not genes [11‐ 14] contributes little to the overall DNA methylation level or the silencing of its targets [12,  14‐17].

We have previously shown that RdDM endows its targets with the ability to regain wild type  (wt) DNA methylation following ddm1‐induced loss of DNA methylation [14]. Moreover, we  demonstrated that the RdDM pathway is active in ddm1 plants, being able to promote low‐ level  DNA  methylation  over  its  targets.  These  observations  indicate  that  DDM1‐dependent  DNA methylation and RdDM act concomitantly over a subset of repeat elements. Here, we  show  that  the  simultaneous  disruption  of  these  two  DNA  methylation  pathways  leads  to  severe,  fully  penetrant  phenotypic  alterations  as  well  as  widespread  changes  in  gene  expression.  However,  detailed  analysis  indicates  that  most  of  these  defects  are  caused  by  the  misexpression  of  a  few  pleiotropic  genes  and  that  most  genes  are  insensitive  to  the  epigenetic  status  of  neighboring  repeat  elements.  Taken  together,  our  findings  reveal  a  limited  yet  critical  direct  function  of  RdDM  and  DDM1‐dependent  DNA  methylation  in  preserving normal expression of genes in Arabidopsis.

Compromising  together  DDM1‐dependent  methylation  and  RdDM  leads  to  severe  and  fully penetrant phenotypic alterations 

To  understand  better  the  genetic  interplay  between  RdDM  and  DDM1‐dependent  DNA  methylation and their impact on the expression of genes located near repeat elements, we  generated  mutant  plants  affected  in  these  two  pathways.  Double  mutant  plants  were  obtained  at  the  expected  Mendelian  ratio  of  1/16  in  the  F2  progeny  of  a  cross  between  ddm1 and a mutant line for the RNA DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 gene, which is a key  component  of  RdDM  (supplementary  Table  S1).  In  contrast  to  these  two  parental  lines  however,  first  generation  ddm1rdr2  double  mutant  plants  exhibited  severe  and  fully  or  nearly  fully  penetrant  phenotypic  alterations.  These  alterations  were  characterized  in  the  following  generation  (F3)  and  included  wrinkled  leaves,  thin  stems,  small  stature,  late‐ flowering, and partial sterility (Fig 1). Further selfing led to even more severe defects as well  as  to  the  stochastic  appearance  of  additional  phenotypes.  Similar  phenotypic  alterations  including  progressive  degeneracy  were  also  observed  when  the  ddm1  mutation  was  combined with a mutation in the genes NUCLEAR RNA POLYMERASE D2 (NRPD2) or DICER‐ LIKE  2  (DCL2)  and  DCL3,  which  encode  other  key  components  of  RdDM.(supplementary  Fig  S1).  Thus,  compromising  simultaneously  DDM1‐dependent  DNA  methylation  and  RdDM  causes a robust suite of phenotypic defects. We therefore conclude that these two pathways  act redundantly to enable normal plant development.