Cycle viral 3

Le cycle viral du VIH peut être divisé en deux phases, soit la phase précoce et la phase tardive. La phase précoce est caractérisée par l’attachement du virus à la cellule cible, par la fusion du virus, la décapsidation et transcription inverse, puis le transport nucléaire et l’intégration. La phase tardive est amorcée par la synthèse d’ARN, l’ épissage, l’export nucléaire, la production de protéines, l’assemblage, le bourgeonnement et la maturation du virus9 (Figure 1.3). L’entrée du VIH-l dans les cellules cibles requiert une interaction avec les protéines de l’enveloppe du VIH-l , le récepteur cellulaire CD4 et un corécepteur (CCR5 ou CXCR4)10,11. Le VIH est alors attaché à la cellule cible.

Il est à noter que le virus utilise principalement le CCR5 au début de l’ infection alors que le CXCR4 est favorisé plus tard dans l’évolution de la maladie12. Suite à l’attachement du virus, une cascade de changements est initiée et aboutit à la fusion entre le virus et la membrane de la cel1ule hôte9,13. La capside du VIH est alors relâchée dans le cytoplasme de la cel1ule. Ainsi, plusieurs enzymes incluant la transcriptase inverse (RT) et l’intégrase (IN) sont libérés dans le cytoplasme en plus de l’ARN génomique viral qui est protégé par la capside virale (CA). Cette étape est suivie de la décapsidation de la CA afin de libérer l’ ARN viral et le rendre accessible pour la prochaine étape, soit la transcription inverse. L’enzyme transcriptase inverse relâchée plus tôt dans le cytoplasme peut alors convertir l’ ARN viral en ADN viral, ce qui va permettre au virus de s’intégrer au génome de la cellule hôte. Enfin, l’ADN viral est transporté jusqu’au noyau. Une fois à l’intérieur de ce dernier, l’intégrase permet l’intégration de l’ADN viral dans l’ADN de la cellule hôte. Cette dernière étape met fin au cycle viral précoce du VIH. Le cycle tardif n’est pas expliqué en détail, puisqu’il n’est pas pertinent à la présente étude.

Cellules cibles

Les cellules sangumes se divisent en trois catégories, soit les leucocytes, les érythrocytes et les thrombocytes. Les érythrocytes transportent de l’oxygène et les thrombocytes tiennent un rôle important pour la coagulation sanguine. Les cellules pertinentes à cette étude sont les leucocytes, puisque ce sont des cellules du système immunitaire en partie responsable de la protection du corps contre les virus et bactéries envahisseurs. Ils interviennent dans la réponse immunitaire innée et la réponse immunitaire adaptative. La réponse immunitaire innée est la première réponse de l’organisme lors de l’invasion par un pathogène. Diverses cellules sont principalement impliquées dans cette réponse (les macrophages, les monocytes, les cellules NK, les cellules dendritiques, etc.) et participent à l’élimination du pathogène. La réponse immunitaire adaptative fait suite à la réponse immunitaire innée. Celle-ci se base sur la reconnaissance et la mémorisation des agents pathogènes et implique principalement deux types de cellules, soit les lymphocytes T et les lymphocytes B. Ce sont les cellules exprimant le CD4 et un des corécepteurs mentionnés précédemment (CCR5 ou CXCR4) qui peuvent être infectées par le VIH. Parmi ces cellules, on retrouve les lymphocytes T CD4+, les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques. Lorsque l’enveloppe du virus reconnaît le CD4 et le corécepteur à la surface de la cellule, il s’y attache et fusionne avec la membrane de la cellule. Cette fusion permet de libérer la capside virale dans le cytoplasme de la cellule et la poursuite du cycle viral à l’intérieur de la cellule hôte.

Mécanismes d’inhibition

Comme expliqué plus tôt, TRIM5a lie spécifiquement la capside des rétrovirus après leur entrée dans le cytoplasme dans la phase précoce du cycle viral. TRIM5a permet ensuite le désassemblage des virus via divers mécanismes, dont la dégradation par le protéasome2 1 ,33 . Le protéasome est un complexe enzymatique formé de protéases qui sert à dégrader des protéines. Les protéines à dégrader sont marquées par une chaîne d’ubiquitine ce qui permet au protéasome de les reconnaître et d’entraîner leur dégradation34 . Dans le cas de TRIM5a, pour que le protéasome soit recruté, le domaine RING qui est responsable de l’activité E3 ubiquitine ligase est nécessaire35 ,36. Le domaine E3 peut s’auto-ubiquitiner, ce qui résulte en sa dégradation par le protéasome37 . Sans ce domaine (par suppression ou mutation du domaine RING), on observe une perte significative d’efficacité de la restriction causée par la perte de la dégradation par le protéasome36 .

Un autre rôle de la ligase E3Ub associée au domaine RING est de stimuler la synthèse de chaînes d’ubiquitine (Ub). Ces chaînes Ub se lient à diverses protéines et conduisent à l’ activation de facteurs de transcription tels que NF-KB et AP-l dans le cadre de la restriction du voe2 1 . En plus de la dégradation par le protéasome, TRlM5a induit l’accélération de la décapsidation de la capside du rétrovirus après l’entrée du virus dans le cytoplasme (avant même l’étape de la transcription inverse du cycle viral)38. Ce mécanisme est peu connu. En effet, on ignore toujours pourquoi la décapsidation accélérée de la capside nuit à l’infection et l’on ignore aussi comment TRlM5a favorise ce rôle. Un autre rôle connu de TRlM5a est l’altération du transport cellulaire. TRlM5a reconnaît la capside et cela peut éventuellement perturber le cycle viral, soit empêcher la fonction de la RT via le protéasome comme expliqué auparavant ou soit en masquant les motifs d’importation au noyau, donc cela empêche le trafic du complexe de pré-intégration (PIC) qui contient l’ADN vers le noyau de la cellule hôte39. Le transport cellulaire du virus est alors altéré par TRlM5a dû à son autre rôle de décapsidation. De plus, un autre rôle proposé, mais moins connu de cette protéine est qu’elle stimule l’autophagie dans les cellules humaines et entraîne les rétrovirus vers la dégradation autophagique via des interactions avec diverses protéines de l’autophagie2 \ ,32

Virophagie

Un modèle propose que TRIM5a est un récepteur d’autophagie sélective (voir sous-section 1.3.3.2 Sélectif) qui dirige le rétrovirus vers l’autophagie pour sa dégradation67,68. Ce modèle est appelé virophagie. Le modèle supporte l’idée que TRIM5a interagit avec divers marqueurs de l’autophagie tels que p6232 . Il est suggéré que TRIM5a reconnaît directement la capside rétrovirale et l’achemine vers les membranes de ce qui va former l’autophagosome puis être dégradé par fusion avec les lysosomes (Figure 1.6)69. Ce modèle présente plusieurs limitations d’où sa controverse dont le fait qu’il a été étudié dans une seule lignée cellulaire soit les cellules de Langerhans (des macrophages retrouvés dans le tissu cutané et les muqueuses) non pertinentes à l’étude des rétrovirus (comme le Vlli) impliquant TRIM5a. Ces cellules rie sont pas facilement infectées par le Vlli. De plus, après l’entrée du virus dans les cellules de Langerhans, le virus se fait dégrader par les granules de Birbeck. Ces granules sont retrouvées uniquement dans les cellules de Langerhans. Ainsi, il est difficile de comparer les résultats trouvés dans l’article avec d’autres lignées cellulaires. Ce modèle est donc possible, mais il reste encore beaucoup à découvrir pour le confirmer dans les cellules infectées par le VIH. Autre que ce modèle, certains liens entre le Vlli et l’autophagie sont connus dans la littérature. Des études suggèrent que le Vlli prend contrôle de l’autophagie pour éviter sa dégradation et son élimination. La protéine virale Nef se lie à Beclin 1 et bloque ainsi la maturation de l’autophagosome7o. Dans le cas des protéines de l’enveloppe du Vlli, elles activent mTOR ce qui, à son tour, inhibe l’autophagie et entrave la dégradation et élimination du virus68.

Production de vecteurs viraux Le plasmide incapable de réplication pNL4-30FPLlEnvLlNef77 (appelé simplement NL4-30FP) a été produit tel que décrit par Merindol et al. dans lequel une suppression a provoqué un changement de cadre dans le gène env et dans lequel gfp remplace le gène nef3. Les séquences de capsides de EC5-1 ont été amplifiées et insérées dans pNL4-30FP en utilisant l’ADN ligase T4 (New England Biolabs) tel que décrit par Merindol et al. 23 Des bactéries JM 109 ont été électroporées telles que décrites par Merindol et al. 23, avec le plasmide et mises en culture sur géloses de LB Broth (Miller). Le plasmide a été purifié en utilisant le Qiagen MidiPrep kit. Le plasmide a été digéré pendant une heure à 37 oC par l’enzyme HindIII (Thermo Fisher) puis migré sur gel de 1 % d’agarose pour vérifier si le plasmide comprend les bonnes constructions. Le plasmide NL4-30FP a aussi été digéré et migré comme contrôle positif. Le plasmide NL4-30FP contenant EC5-1 a été cotransfecté avec le plasmide pMD2G (VSV-G) dans des cellules HEK293T à 90 % de confluence avec du polyethylenimine PEI (polysciences, Niles, IL)78. Pour le contrôle négatif, le plasmide pMD2G (VSV-G) a été transfecté dans les HEK293. Le milieu de culture a été changé 6 heures après la transfection et le virus et le contrôle négatif ont été récoltés 24 h, 48 h et 72 h plus tard, purifiés par centrifugation de 10 min à 3000 rpm et les surnageants contenant le virus ou le contrôle ont été conservé à -80 oC. La multiplicité d’infection (MOI) du rétrovirus a été déterminée par titration dans des cellules de chats permissives aux virus (CRFK). Pour le virus N-ML V, les plasmides pMD2G (VSV-G), pCNCG (GFP) et pCIG3-N ont été cotransfectés dans des cellules HEK293T à 90 % de confluence comme décrit pour EC5-1 précédemment. La MOI a également été déterminée pour N-ML V dans les CRFK. Dans le cas du virus B-ML V, le plasmide pCIG3-B remplace pCIG3-N et le reste de la technique demeure la même.