Identification des protéines du complexe

Protéines identifiées par affinité (streptavidine immobilisée) 

Choix de la séquence biotine-ADN

 Nous avons développé un protocole d’identification par affinité en utilisant de la streptavidine immobilisée. A cette fin, nous avons synthétisé la séquence BTlev (cf. tableau 4.1.) sur la base de la séquence Tlev, en prenant soin d’éloigner par une suite de thymines, la biotine de la partie Tlev. Si les protéines s’associent à la séquence Tlev sous une forme structurale en motif i ou sous une autre, l’ajout d’une biotine à l’extrémité 5’ de la séquence ne devrait pas perturber la structure adoptée par l’ADN. Identification des protéines du complexe . Quelle que soit la structure adoptée par la séquence Tlev et reconnue par les protéines, la formation du complexe ADN-protéines doit rester possible malgré la présence d’une biotine à l’extrémité 5’ et la proximité immédiate de la streptavidine et de son support. Pour nous assurer que la séquence modifiée n’entraînera pas l’association artéfactuelle d’autres protéines, et vérifier la longueur du segment de thymines nécessaire et suffisant pour ne pas perturber la structure adoptée par l’ADN, nous avons réalisé plusieurs essais de migrations électrophorétiques en conditions natives, à partir de protéines non purifiées et de séquences présentant des variations de la longueur du bras de thymines (tableau 4.1.). Noms Séquences (5’→3’) Tlev d(CCCACACCCACACCCACACCC) TBT2Tlev dT-B-d(TTCCCACACCCACACCCACACCC) T4Tlev d(TTTTCCCACACCCACACCCACACCC) BTlev B-d(TTTTCCCACACCCACACCCACACCC) TBTlev dT-B-d(TTTTCCCACACCCACACCCACACCC) TBT7Tlev dT-B-d(TTTTTTTCCCACACCCACACCCACACCC) Tableau 4.1. : Séquences testées en prévision de la séparation par affinité. On constate que l’insertion d’une biotine (séquences BTlev* et TBTlev*, figure 4.2.), de même que l’allongement de la séquence Tlev par une suite de 4 thymines (séquence T4Tlev*), ne permet pas de visualiser de nouvelle bande de protéines intense. Il en va de même lors de tests réalisés pour des suites de 2 ou 7 thymines (résultats non montrés). On remarque également que le rendement de kination est moins bon pour ces séquences qu’avec la séquence Tlev* (notamment pour la séquence BTlev* où la biotine est située à l’extrémité 5’ du fragment d’ADN). . Les concentrations en ADN* sont identiques (~ 65 nM). Sites de fixation spécifiques ~ 0.5pmol Tlev* TBTlev* BTlev* T4Tlev* Extraits de protéines + – – – – + – – – + – + – – + – – + – + – – – + + En fonction de ces expériences, le choix du ligand utilisé pour les expériences de séparation par affinité s’est porté sur la séquence BTlev, dont les rendements de synthèse étaient supérieurs à ceux de séquences plus longues.

Le complexe streptavidine-biotine-ADN-protéines 

Nous avons vérifié la formation d’un complexe streptavidine-biotine-ADN-protéines unique par migration électrophorétique en conditions natives. Pour cela, nous avons utilisé la séquence TBTlev* comme sonde radioactive. Dans un premier essai, nous avons vérifié que cette séquence s’associait avec de la streptavidine à pH 8, température ambiante, en présence de KCl 50 mM durant 15 minutes dans un volume d’incubation de 25 µl (figure 4.3.a.). Nous avons constaté la présence d’un complexe streptavidine-biotine-ADN-protéines (sous la forme d’une bande retardée supplémentaire) après incubation dans des conditions d’incubation non dénaturantes (figure 4.3.b.). De plus, l’intensité de la bande retardée habituellement observée a diminué. – 10 32.5 en pmole Streptavidine Sites de fixation spécifiques : ~1pmoles TBTlev* : 1 pmole Streptavidine Complexe Streptavidine TBTlev* protéines Complexe TBTlev*-protéines Streptavidine 6.5 pmole par piste 0.8 2.6 7.8 en pmole TBTlev* (a) Complexe streptavidine-TBTlev* en fonction de [TBTlev*] (b) Complexe streptavidine-TBTlev* -protéines en fonction de [streptavidine] Figure 4.3. : (a) Formation du complexe streptavidine-biotine-ADN. (b) Formation du complexe streptavidine-biotine-ADN-protéines unique.

Description du mode opératoire 

Afin de vérifier qu’il n’existait pas d’interaction entre la résine-streptavidine et les protéines, nous avons procédé à des essais d’incubation par lots entre la résine (sans le ligand d’ADN) et les protéines. Pour un rapport égal à 1/5 et une incubation de 18h à 4°C dans TBE 0.5x, pH 7.4, 150 mM KCl, l’activité retardante n’est pas affectée. Mais elle est perdue, de même que toutes les autres protéines de l’extrait, si le rapport (volume de billes en suspension (1.4 mg de streptavidine / ml de Chapitre IV. Identification des protéines du complexe – 73 – résine en suspension) / volume de protéines (1mg de protéines /ml d’extraits)) est supérieur à 1 (vraisemblablement suite à une agrégation ou un amalgame entre résine et protéines). Lors de nos essais de purification par affinité, nous avons travaillé avec 20 µl de résinestreptavidine en suspension (~ 2 nmol de sites de fixation de biotine ), pour 100 – 200µl d’extraits protéiques (~ 8 – 24 pmol de sites de fixation spécifiques), à pH 7.4 et température ambiante. 

Essais de purification en conditions natives

 Selon le principe de la séparation par affinité, après incubation des protéines avec la résine-streptavidine préalablement saturée en ADN ligand BTlev, nous avons procédé à des lavages successifs des billes avec le même tampon que celui servant à l’incubation (6 x 1 ml de TBE 0.5x, pH 7.4, 150 mM KCl), avant d’essayer de séparer les protéines du ligand BTlev par élution. Complexe Tlev*-protéines Sans BTlev AvecBTlev Les protéines sont fixées sur le ligand et ne sont plus dans le surnageant 1 2 3 4 5 3’ 4’ 5’ 1 : Tlev* 2 : Tlev* + protéines de levure 3, 3’ : Surnageant après incubation entre protéines de levure et résine-streptavidine 4, 4’ : 5 premiers lavages successifs après reconcentration 5, 5’ : 6ème et dernier lavage après reconcentration – Pour contrôler l’efficacité de l’association spécifique des protéines avec le ligand, nous avons observé systématiquement par migration électrophorétique non dénaturante, les différents surnageants obtenus lors des lavages (figure 4.4.). Aucune bande retardée n’étant relevée pour ces lavages, nous en avons conclu que les protéines sont effectivement fixées sur la matrice d’affinité. Pour procéder à la séparation entre protéines et ligands, nous avons testé différentes conditions d’élution : – variation du pH (de pH 7 à pH 8) – augmentation de la force ionique (de 150 mM à 2 M KCl) – passage en NaCl (variation de la concentration de 150 mM à 2 M) – passage en urée (de 2 à 6 M, puis élimination de l’urée par filtration à l’aide des tubes reconcentrateurs). Aucun de ces procédés n’a permis d’obtenir une activité retardante. Deux types d’explications sont possibles : – les protéines sont restées liées à l’ADN sur les billes; – les protéines recherchées sont partiellement éluées, mais le complexe protéique s’est dissocié de manière irréversible pendant ou après l’élution.