L’ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX DESINFECTANT

 L’ensemble des méthodes utilisées pour mesurer la sensibilité des bactéries aux désinfectants sont des méthodes initialement élaborées pour l’étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Les méthodes de mesure de la sensibilité rejoignent les objectifs des méthodes de typage et doivent donc présenter les qualités suivantes : ¾ Elles doivent avoir un pouvoir discriminant suffisant pour permettre le classement des souches en sous-population sensible et résistante ¾ Elles doivent être répétables et reproductibles ¾ Elles doivent pouvoir être applicables à toutes les souches bactériennes de l’espèce ou du genre considéré ¾ Elles doivent être faciles à mettre en œuvre, pour un coût modéré Les antibiotiques et les désinfectants présentent des modes d’action différents et les désinfectants sont beaucoup plus sensibles aux conditions physico-chimiques du milieu que les antibiotiques. Ainsi, l’étude de la sensibilité aux désinfectants pose deux problèmes majeurs par rapport aux antibiotiques : l’un d’ordre terminologique et l’autre d’ordre méthodologique : ¾ Il n’existe pas pour l’instant de définition standardisée de la résistance aux désinfectants et les différentes définitions données dans la littérature sont le plus souvent propres aux auteurs qui les proposent. La définition de la résistance étant intrinsèquement liée à la méthode d’étude choisie, l’idéal serait de pouvoir disposer d’une méthode permettant la mise en évidence, sans avoir recours à un seuil arbitraire, de deux sous-populations ou plus, comme cela est souvent le cas pour les distributions de CMI des bactéries vis à vis des antibiotiques. ¾ Les désinfectants sont très sensibles à la présence de la matière organique. Lorsqu’ils sont mélangés dans un milieu de culture pour les bactéries on ignore quelle quantité de désinfectant est encore active et disponible dans le milieu et si le milieu est toujours favorable à la croissance bactérienne. A l’heure actuelle, seule la méthode de mesure des CMB permet d’évaluer l’efficacité des désinfectants. Malheureusement, cette méthode ne permet pas de mettre en évidence de petites variations de sensibilité des bactéries aux désinfectants. Les méthodes présentées dans ce chapitre, que nous avons évaluées, avaient pour objectifs : ¾ soit d’améliorer le pouvoir discriminant de méthodes disponibles pour l’évaluation de la sensibilité au désinfectant (diminution des pas de dilution, ajout de désinfectant dans un milieu sélectif), ¾ soit de mettre au point des méthodes permettant de s’affranchir des difficultés liées aux interactions entre les désinfectants et les milieux de culture (diffusion en milieu gélosé)

Diminution des pas de dilution des solutions désinfectantes

La méthode de dilution en milieu gélosé utilisée dans notre étude pour les désinfectants est adaptée directement de la méthode utilisée pour les antibiotiques. Les pas de dilutions sont de 2 en 2, ce qui entraîne de grands écarts de concentrations pour les premières dilutions. Pour la majorité des antibiotiques, les courbes de distribution obtenues ont une allure bimodale ce qui permet aisément de distinguer deux sous-populations au sein de la population testée. Pour les composés d’ammoniums quaternaires, les courbes de distributions des CMI des souches de notre étude sont monomodales. Afin de vérifier qu’une courbe bimodale des distibutions n’était pas masquée par de trop grands pas de dilution, une gamme de dilution a été repréparée avec des pas de dilution plus petits pour les valeurs de CMI les plus fréquemment observées. 2.1 Sélection des souches Dans notre collection d’isolats (651 isolats), la majorité appartient à l’espèce C. jejuni, nous avons donc sélectionné au hasard 60 souches de C. jejuni. Les distributions de CMI de l’ensemble des souches de la collection et des souches sélectionnées pour le chlorure de benzalkonium (CB) et le didécyl-diméthyl ammonium (CDDA) sont représentées respectivement sur les figures 25 et 26. Les souches tirées au hasard sont représentatives de l’ensemble des souches de la collection. 2.2 Gammes de dilutions étudiées 

Chlorure de benzalkonium 

Pour le chlorure de benzalkonium, près de 70% des isolats de C. jejuni ont une valeur de CMI égale à 8 ou 16 µg/ml. Pour ce désinfectant, les concentrations testées sont : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 24 et 32 µg/ml.

Chlorure de didécyl-diméthyl-ammonium

 Pour le chlorure de didécyl-diméthyl-ammonium, près de 80% des isolats de C. jejuni ont une valeur de CMI égale à 4 ou 8 µg/ml. Pour ce désinfectant, la gamme de dilution est donc étendue entre 2 et 10 µg/ml. Les concentrations testées sont : 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16 et 32 µg/ml. Pour chaque mesure, l’expérience a été répété deux fois. 2.3 Courbes de distribution des CMI avec des pas de dilution réduits Les courbes de distribution sont présentées sur la figure 27 pour le chlorure de benzalkonium et sur la figure 28 pour le chlorure de didécyl-diméthyl ammonium. Pour le chlorure de benzalkonium, les souches qui présentaient une CMI de 8 ou 16 µg/ml sont dispersées sur les valeurs intermédiaires entre 4 et 12 µg/ml. Comme les pas de dilution sont petits (12 pas de dilution) et qu’il y a peu de souches testées (43 valeurs retenues pour le chlorure de benzalkonium), la distribution est étalée assez uniformément sur l’ensemble des valeurs étudiées.  Pour le chlorure de didécyl diméthyl ammonium, la courbe de distribution des CMI est proche de celle observée avec les pas de dilution de 2 et les souches qui étaient auparavant sur les valeurs 4 et 8 µg/ml se retrouvent sur les valeurs 4 et 6 µg/ml. 

Intérêt de la diminution des pas de dilution des molécules désinfectantes pour l’étude de la sensiblité aux antibiotiques Pour ces deux molécules, la diminution des écarts de dilution dans la gamme ne permet pas de mettre en évidence deux sous-populations distinctes. Il n’y a donc pas d’intérêt, pour C. jejuni et pour ces deux molécules d’ammoniums quaternaires d’augmenter le nombre de dilutions testées.

Utilisation de molécules désinfectantes dans le milieu sélectif de Virion

 Principe 

L’étude de la résistance aux désinfectants suppose de travailler sur un phénomène rare. Par conséquent, on peut supposer que les souches résistantes aux désinfectants sont peu représentées dans les populations de bactéries prélevées dans les abattoirs. En raison de la méthode d’isolement utilisée, seules les bactéries les plus compétitives sont détectables. Pour favoriser la détection de bactéries présentes en petit nombre au départ, un milieu sélectif additionné d’un désinfectant dédié à leur sélection a été utilisé. 

Méthode

 Les milieux sélectifs utilisés pour l’isolement des campylobacters à partir des prélèvements d’abattoir sont le milieu de Karmali et le milieu de Virion. Cette méthode n’a été utilisée qu’au cours de 2 visites. 

Comparaison des CMI en milieu de Karmali par rapport à la GMH

Le milieu de Karmali est un milieu contenant du charbon. Sur ce milieu contenant des concentrations croissantes de CB (de 0 à 25 µg/ml), 8 souches de C. jejuni présentant des CMI en GMH de 1.5 à 25 µg/ml ont été testées. Pour toutes les souches, la croissance était identique à la croissance dans la boite témoin quelque soit la concentration de CB ajoutée au milieu de Karmali. Le CB n’est donc plus actif en milieu de Karmali. 

Comparaison des CMI en milieu de Virion par rapport à la GMH

 Le milieu de Virion est une gélose de Mueller-Hinton complémentée avec du sang de mouton défibriné (5%) et des antibiotiques. Les deux souches de référence C. jejuni ATCC 33560 (CMI du CB en GMH=6.25 µg/ml)et C. coli ATCC 33559 (CMI du CB en GMH=12.5µg/ml) ont été utilisées. De la même façon que pour le milieu de Karmali, le milieu de Virion a été additionné avec des concentrations croissantes de CB de 0 à 32 µg/ml. Les résultats obtenus montrent que : ¾ Le milieu de Virion reste sélectif en présence de chlorure de benzalkonium aux concentrations testées