Mise au point de protocoles d’extraction de l’azadirachtine à l’échelle du laboratoire et semi-industrielle (pilote)

Mise au point de protocoles d’extraction de l’azadirachtine à l’échelle du laboratoire et semi-industrielle (pilote)

Les origines de l’utilisation des produits naturels dans la lutte contre les insectes

Il nous faut remonter très loin dans l’histoire pour comprendre les raisons qui ont conduit l’humanité à se doter d’un arsenal de produits chimiques pour tenter d’assurer à l’ensemble des populations une quantité adéquate de nourriture et pour combattre un grand nombre de maladies transmises par les Arthropodes. Depuis plus de 12 000 ans, l’homme commençait à cultiver, c’est-à-dire à créer des agroécosystèmes. Ce sont des environnements simplifiés où se répète la même variété de plante, rangée après rangée. Cette concentration de la même espèce, de la même variété, rend facile le travail des insectes phytophages et accroit considérablement leur potentiel reproducteur. A ces attaques par les insectes, il faut ajouter la contamination par les pathogènes et l’envahissement des mauvaises herbes.35 Devant cette prolifération d’organismes nuisibles, et en particulier d’insectes phytophages s’attaquant aux ressources nécessaires au bien-être de l’humanité, un programme de lutte bien pensé a été entrepris. Ce programme prend en compte les équilibres biotiques et abiotiques. Cette approche prend en considération autant les besoins alimentaire et sanitaire d’une population toujours croissante que la préservation de l’environnement. En effet, l’emploi de produits insecticides naturels et en particulier ceux d’origine végétale remonte à des temps très anciens. Ces produits insecticides employés jusqu’à une période très récente, ont connu un déclin suite à la découverte de substances chimiques de synthèse répartie en trois générations de pesticides: la première génération est constituée des composés à base d’arsenic, de soufre, de chaux, des dérivés du pétrole, des substances à base de fluor. la deuxième génération regroupe les organochlorés, les organophosphorés, les carbamates. la troisième génération est celle des substances produites par les plantes elles-mêmes, soit les hormones des insectes et leurs analogues. Mais la lutte chimique, malgré ses avantages indéniables, ne tarda pas à montrer ses limites par son spectre d’action sur les écosystèmes, notamment en raison de la pollution de l’environnement et des problèmes d’intoxication à l’encontre d’une multitude d’organismes souvent non-ciblés. C’est dans ce contexte que l’on note un regain d’intérêt des substances qualifiées de « bio-pesticides » ou « pesticides écologiques » en particulier les produits insecticides d’origine végétale qui sont peu toxiques pour l’homme et pour l’ensemble des composantes de l’environnement. La capacité que possèdent les plantes à se protéger a été réexaminée en détail depuis le début du siècle36 en vue d’être exploitée à des fins agronomiques. La lutte contre les insectes entre donc dans une nouvelle phase puisque cette approche « botanique » fournit des moyens en meilleure harmonie avec l’environnement, moyens provenant des organismes à protéger eux-mêmes. Ces composés naturels et leurs dérivés devraient pouvoir réduire sensiblement les pertes subies par les plantes cultivées et la forêt. Ils devraient aussi servir de base pour la mise au point de nouvelles molécules capables d’anéantir les vecteurs de maladies. Les progrès notoires qui ont été accomplis dans ce domaine depuis le début de la présente décennie sont dus en grande partie à la collaboration étroite des phytotechniciens, des entomologistes, des chimistes et des toxicologues.On peut donc envisager la mise au point d’insecticides plus spécifiques, non toxiques pour les organismes non-visés, biodégradables, et moins susceptibles de provoquer la résistance chez les espèces cibles. Il est aussi possible d’entrevoir, dans le contexte d’un développement soutenu, la production de molécules écologiquement désirables et économiquement adaptées aux pays les moins nantis comme le Sénégal. Les plantes synthétisent de nombreux métabolites secondaires dotés de propriétés répulsives, anti-apétantes ou biocides à l’égard des herbivores. Le régne végétal constitue la plus riche source de produits insecticides naturels du monde soit plus de 400.000 substances chimiques (terpènes, alcaloïdes, phénols, tannins) ont été reporttés dans la littérature.

Utilisation de l’huile de neem dans la lutte contre les ennemis de cultures

Les produits à base d’azadrachtine sont essentiellement des poisons de l’estomac et présentent une toxicité de contact, quand ils sont appliqués à des doses plus élevées. L’huile de neem brute agit efficacement comme un poison de contact particulier contre les insectes et les acariens à corps mou47. Action systémique est possible dans le cas de l’application du sol ou de la tige d’injection48. Dans des conditions de laboratoire l’efficacité biologique et les modes d’action de phytochimiques du neem sont pour la plupart dépendant de la dose.

Effets de l’huile de neem sur les cellules de l’intestin moyen des larves prédatrices Ceraeochrysa claveri

Les effets de l’huile de neem ingérée sur les cellules de l’intestin moyen des larves prédatrices Ceraeochrysa claveri ont été analysés. C. claeri ont été nourris avec les œufs de Diatraea saccharalis traitée avec une huile de neem à une concentration de 0,5%, 1% et 2% pendant toute la durée des larves. La microscopie optique et électronique a montré des dommages graves sur les cellules colonnaires, qui ont eu de nombreuses protubérances cytoplasmiques, le regroupement des microvillosités rompus, les cellules gonflées, cellules rompues, la dilatation et la vésiculation du réticulum endoplasmique rugueux, développement de réticulum endoplasmique lisse, l’élargissement des espaces extracellulaires du labyrinthe basal, espaces intercellulaires et une nécrose. L’ingestion indirecte de l’huile de neem avec des proies peut entraîner des altérations graves montrant des effets cytotoxiques directs de l’huile de neem sur les cellules de l’intestin moyen des larves C. claveri.

Activité acaricide de l’huile et quatre de ses sous composés séparés par chromatographie sur colonne

Sarcoptes scabiei est l’un des ectoparasites vétérinaires les plus importantes chez les lapins et entraîne une perte considérable de poids, la productivité et la qualité de la fibre de laine. Les acaricides chimiques ont un effet significatif sur la maladie d’acariens; Cependant, les problèmes de résistance et la toxicité pour l’environnement sont également source de préoccupation. Les acaricides botaniques sont devenus des points focaux de la recherche en raison de leur innocuité pour l’environnement et de l’efficacité.

Extraction et fractionnement

L’huile de neem est extraite des graines avec de l’éther de pétrole. Le fractionnement est fait sur colonne de gel de silice G (100-200 mesh), l’éluant est constitué d’un mélange d’hexane et acétate d’éthyle (8 : 2 v/v). La chromatographie sur couche mince a permit de constituer quatre fractions F1 à F4.

Dosage in vitro de l’activité acaricide

L’extrait d’éther de pétrole et les quatre fractions (F1-F10) ont été dilués, selon la méthode établie par Fichi 51 avec de la paraffine liquide à 500 mL / L. Les larves d’acariens ont été placées dans de petites plaques de polystyrène (8,5 mm de diamètre et 0,3 mm de profondeur) avec 10 acariens par plaque. Les solutions de 10 µL de l’huile de neem non dilué, extrait à l’éther de pétrole le ou les fractions (F1-F4) sont directement ajoutées aux plaques de polystyrène. Les pyréthrines naturelles (500 mg / mL) ont été utilisés comme témoin positif et de la paraffine liquide en tant que témoin négatif. Toutes les plaques ont été placées dans une chambre humide à 75% d’humidité relative et à 25° C et ont été observées par microscope stéréoscopique toutes les 6 heures pendant 24 heures. Chaque plaque est observée pendant 5 minutes, et replacée dans la chambre d’essai.

Table des matières

Introduction générale
1. Contexte
2. Objectifs
Revue Bibliographique
Chapitre 1 : présentation du Sénégal, étude pédoclimatique des régions d’études
I.1. Informations générales sur le Sénégal
I.1.1. Situation géographique du Sénégal
I.1.2. Relief
I.1.3. Climat .
I.1.4. Végétation
I.1.5. Hydrographie .
I.1.6. Population
I.1.7. Economie
I.2. Description des conditions pédoclimatiques des régions de collectes des graines dans cette étude
I.2.1. La Région Dakar
I.2.1.1. Climat et Humidité
I.2.1.2. Température
I.2.1.3. Pluviométrie
I.2.1.4. Les sols de la Régions
I.2.2. La région de Thiès
I.2.2.1. Climat et Température
I.2.2.2. Pluviométrie
I.2.2.3. Humidité de la région
I.2.2.4. Les sols de la région
I.2.3) La région de Louga
I.2.3.1. Climat et Température
I.2.3.2 Pluviométrie
I.2.3.3. Les sols
I.2.4. La région de Diourbel
I.2.4.1. Climat et Température
I.2.4.2. La pluviométrie
I.2.4.3. Les sols de la Région de Diourbel
I.2.4.4. La commune de Touba
I.2.5. La région de Matam
I.2.5.1. Pluviométries
I.2.5.2. Température et humidité
I.2.5.3. Les sols de la région de Matam
I.2.6. La Région de Tambacounda
I.2.6.1. Le climat
I.2.6.2. La pluviométrie
I.2.6.3. Les températures
I.2.6.4. L’insolation
I.2.6.5. L’humidité relative et l’évaporation.
I.2.6.6. Les Sols de la Région de Tambacounda
I.2.7. La région de Kaolack
I.2.7.1. Climat et humidité relative
I.2.7.2. Température
I.2.7.3. Pluviométrie
I.2.7.4. Les sols de la Région de Kaolack
I.2.8 Ressources en Neem du Sénégal et la Répartition géographique
Chapitre 2 : Plantes phytochimiques : le Neem (Azadirachta indica A. Juss) et ses multiples vertus
II.1. Les origines de l’utilisation des produits naturels dans la lutte contre les insectes
II.1.1 Utilisation de l’huile de neem dans la lutte contre les ennemis de cultures
II.1.1.1 Effets de l’huile de neem sur les cellules de l’intestin moyen des larves prédatrices Ceraeochrysa claveri
II.1.1.2. Activité acaricide de l’huile et quatre de ses sous composés séparés par chromatographie sur colonne
II.1.1.2.1. Extraction et fractionnement
II.1.1.2.2. Dosage in vitro de l’activité acaricide
II.1.1.2.3.) Evaluation de la toxicité
II.1.1.3.) La bio-efficacité du neem dans la lutte phytochimique antiparasitaire en agriculture : Spodoptera littoralis
II.1.2. Les principales cultures et ravageurs rencontrés au Sénégal
II.1.3. La lutte apportée aux ravageurs
II.1.3.1. La lutte chimique
II.1.3.2. L’utilisation des huiles essentielles
II.1.3.3. l’utilisation des plantes insecticides
II.2. Le Neem : Chimie et Principe actifs
II.2.1. Description de l’arbre
II.2.2. Caractéristique botanique du Neem
II.2.3. Développement des fruits de Neem
II.2.4.) Formation des limonoïdes
II.2.4.1. Par biosynthèse
II.2.5. Méthodes d’obtention de l’Azadirachtine – A.
II.2.5.1. Synthèse organique de l’Azadirachtine –A.
II.2.5.1.1. Synthèse de Ley et al
II.2.5.1.2. Synthèse de Murai et al
II.2.5.2. Procédés d’extractions de l’azadirachtine à l’échelle du laboratoire et semi industrielle
II.2.5.2.1. Extraction de l’Azadirachtine des graines de Neem selon la méthode Yamasaki et al
II.2.5.2.2. Extraction de l’Azadirachtine des graines de Neem selon la méthode Sharma et al
II.2.5.2.3. Extraction de l’Azadirachtine des graines de Neem selon la méthode Dai et al
II.2.6. Mode d’action de l’Azadirachtine-A
II.2.7. Relation structure – activité
II.2.8. Etude de la stabilité de la molécule d’Azadirachtine-A
II.2.9. Ecotoxicologie du Neem
II.2.. Propriétés médicinales du neem
II.2..1. Composés de Neem comme agents potentiels pour la prévention du cancer et le traitement
II.2..1.1. Les composants de Neem inhibent la prolifération
des cellules du cancer
II.2..1.2. Les effets des composants du neem sur la mort des cellules cancéreuses
II.2..1.3. Synthèse de nanoparticules d’argent antibactériens
en utilisant une solution aqueuse de gomme de neem (Azadirachta indica)
II.2..1.4. L’utilisation de l’huile de neem en cosmétique
II.2.. Utilisation du tourteau de neem dans l’alimentation du bétail
II.2..1. Le tourteau de neem aliment de poulet
II.2.12. L’utilisation du tourteau de neem comme fertilisant : Engrais.
II.2.. Le neem source de biocarburant.
II.2..1. Production de biodiésel à base d’huile de neem
II.2..1.1. Les raisons du remplacement des carburants dérivés du pétrole
II.2..1.2. L’huile de neem une source alternative.
II.2..1.3. Méthode de production du biodiésel (Ali et al
.2)
Partie Expérimentale : Chapitre 3 : Rappels des techniques d’extractions et d’analyses ; collecte de graines de neem (Azadirachta indica)
III.1. Rappels des techniques d’extraction et d’analyse
III.1.1. Les techniques d’extraction
III.1.1.1. L’extraction solide/liquide
III.1.1.1.1. L’Extraction par agitation
III.1.1.1.2. L’Extraction au soxhlet.
III.1.1.1.2.1.) Description du montage de l’extraction au soxhlet
III.1.1.2. l’extraction par fluide liquide et supercritique
III.1.1.2.1. Description de la technique
III.1.1.3. L’extraction liquide/liquide
III.1.1.3.1. description de la technique
III.1.2. Les techniques d’analyses
III.1.2.1. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
III.1.2.1.1. Principe de la RMN
III.1.2.1.2. Description de le technique de la RMN
III.1.2.2. La Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)
III.1.2.2.1. Principe de la CLHP
III.1.2.2.2. Description de la technique CLHP
III.2. La collecte des fruits de Neem
III.2.1. Collecte dans la région de Dakar
III.2.2. Collecte dans la région de Thiès
III.2.3. Collecte dans la région de Louga
III.2.4. Collecte dans la région de Diourbel
III.2.4.1. Collecte dans la commune de Diourbel
III.2.4.2. Collecte dans la commune de Touba
III.2.5. Collecte dans la région de Matam
III.2.6. Collecte dans la Région de Tambacounda
III.2.7. Collecte dans la région de Kaolack
Chapitre 4 : Extraction et dosage de la teneur en Azadirachtine-A (Aza-A) dans les fruits de neem des régions de collectes
IV.1. Procédure d’extractions
IV.1.1. Broyage des amandes
IV.1.2. Détermination de la teneur en huiles dans les fruits de neem
IV.1.3. L’extraction de l’Aza-A
IV.1.3.1. Extraction de l’Aza-A dans l’huile de neem
IV.1.3.2. Extraction de l’Aza-A dans le tourteau
IV.2. Dosage de l’Aza-A
IV.2.1. Préparation de l’étalon d’Aza-A
IV.2.1.1. Purification par chromatographie flash automatisé
IV.2.1.2. Purification à la CLHP préparatrice
IV.2.2. Détermination de la droite d’étalonnage
IV.2.3. Autres méthodes de purifications tentées
IV.2.3.1. La méthode par précipitation
IV.2.3.2. Purification sur colonne de micro-silice
IV.2.3.3. Purification par recristallisation
IV.2.4. Résultats des dosages de l’Aza-A pour les différentes régions de collecte
IV.2.4.1. La région de Dakar
IV.2.4.2. La région de Thiès (Commune de Tivaoune)1
IV.2.4.3. La région de Diourbel
IV.2.4.4. La région de Louga
IV.2.4.5. La région de Matam.
IV.2.4.6. La région de Kaolack
IV.2.4.7. La région de Tambacounda
IV.2.4.8. Analyse des résultats des dosages de l’Aza-A pour les différentes régions de collectes
IV.3. Influence de la granulométrie sur les rendements d’extraction en Aza-A
IV.3.1. Répartition granulométrique
IV.3.2. Extraction et quantification de l’Aza-A
IV.3.2.1. Résultats de l’extraction
IV.4. Influence du rapport MeOH/H2O sur l’extraction de l’Aza-A
IV.4.1. Résultats d’extraction
IV.5. Influence du rapport volume solvant d’extraction / masse de tourteau sur l’extraction de l’Aza-A7
IV.5.1. Résultats des extractions
IV.6. Impact de la durée d’agitation (ou extraction) sur le rendement en Aza-A
IV.6.1. L’extraction en trois étapes (3 x 1 heure)
IV.6.1.1. Résultats des extractions
IV.7. Influences des solvants sur l’extraction de l’Aza-A
IV.7.1. Extraction avec % méthanol (MeOH)
IV.7.2. Extraction avec % eau (H2O)
IV.7.3. Comparaison des systèmes de solvants MeOH/H2O et EtOH/H2O
IV.8. La teneur en huile dans les fruits de neem des différentes régions étudiées
IV.8.1. Facteurs climatiques et formation d’huile dans les fruits de neem
IV.9. Extraction au CO2 supercritique
IV.9.1. Matériels et Méthode
IV.9.1.2. Les conditions opératoires choisies sont les suivantes
IV.9.2. Description du mode opératoire
IV.9.3.) Résultats des extractions au CO2 critique
IV.. Extraction à l’échelle semi-industrielle : sur pilote
IV..1. Matériels et méthode
IV..1.1. Matériel végétal
IV..1.2. Solvants utilisés
IV..1.3. Appareils et verrerie
IV..1.3.1. Description du pilote
IV..2. Description du mode opératoire
IV..2.1. Délipidation du broyat
IV..2.2. Extraction des limonoïdes du tourteau
IV..2.3. Extraction liquide-liquide
IV..2.4. Concentration de l’extrait (MTBE + limonoïdes)
IV..3. Résultats des extractions sur pilote
IV.. Matériels et méthodes d’analyses
IV..1. Spectroscopies RMN (1H et C)
IV..2. Spectroscopie Masse
IV..3. Dosage CLHP des extraits d’azadirachtine technique.
IV..4. Référence des appareils utilisés
Discussion
Conclusion et Perspectives
Article de la Thèse