NOTION D’ECHELLE DANS LES METHODES SEPARATIVES

SEPARATION DE CATECHOLS ET DE CATECHOLAMINES PAR ELECTROPHORESE ET CHROMATOGRAPHIE ELECTROCINETIQUE MICELLAIRE

 La figure 1 montre la séparation électrocinétique capillaire d’un mélange de catéchols et de catécholamines (voir formules en Annexe) en milieu tampon phosphate, à pH 7. Préciser le mécanisme de cette séparation et interpréter l’ordre de migration. La durée de l’analyse peut être très sensi-blement diminuée en opérant au même pH, mais en milieu borate (figure 2). L’ordre de migration est alors profondément modifié. Interpréter, sachant que les ions borate donnent, avec les composés a-hydroxylés, des complexes de la forme :

   — C — OH        – C — O       OH
         HBO2 +            B                        +   H+ 
  — C– OH             – C — O       OH
 
  Quelle(s) explication(s) complémentaire(s) fournissent les résultats donnés figure 3 ?
 
 
         Données :
 
Concentration micellaire critique du SDS : 8 mM
Indices de Rekker :        – CH3 : 0,702         – CH2 – : 0,530                   – CH : 0,235 ( al ) – NH2 : – 1,428  ( al ) – NH – : – 1,825
         ( al ) – OH : – 1,491           ( al ) – CO2H : – 0,954

Tampon avec 20 mM SDS >CMC (8 mM) donc MEKC
 
         Séparation des neutres entre eux par interaction hydrophobes
         Micelle anionique donc séparation des chargés +1 par interaction électrostatique et hydrophobe
 
Incidence de la charge sur l’ordre de sortie
 
Tm neutre < tm chargé +1
 
Normal car les chargés +1 interagissent avec les micelles anioniques donc plus retenu
 
Pour les neutres : Interactions hydrophobes
 
Séparation suivant l’hydrophobie croissante donc indice de Rekker
 
Log Peau/octanol = ∑fi  donc décomposer la molécule en différent morceaux
 
Plus le log P augmente, plus la molécule est hydrophobe.
 
Partie commune du catéchol log P0
 
L-DOPA : log P = log P0 + fCH2 + fCH + fCOOH + fNH2
                     = log P0 + 0,530 + 0,235 – 0,954 – 1,428
                     = log P0 -1,62
CAT     : log P = log P0
MC      : log P = log P0 + 0,702
NE       : log P = log P0 – 2,15
E          : log P = log P0 – 1,85
DHBA : log P = log P0 – 0,9
DA      : log P = log P0 – 0,37
 
Ordre attendu
 
En résumé, priorité à la charge globale et ensuite hydrophobicité.
 
Tampon phosphate – borate pH 7 avec SDS :
 
Ordre modifié et tr bien diminuée.
 
Changement de charge :
 
Composés 1 – 4 sont devenus neutre et composés 5 – 7 chargé négativement
 
 Inversion des familles.
 
1 – 4 : Hydrophobie rentre en jeu, plus d’interaction électrostatique.
5 – 7 : Plus d’attraction électrostatique (répulsion avec les micelles donc pas d’inclusion)
 
1 – 2 – 3 – 4 : ordre d’hydrophobie (Rekker) donc ordre attendu
5 – 7 – 6    : composés chargés, se séparent par différence de mobilité (taille)
 
Tampon borate pH 7 sans SDS :
 
On attend :
 

•       Absence de séparation des composés neutres 1 – 4
•       Séparation des 3 autres comme précédemment (taille)

 
 
Séparation 5 – 7 – 6 :
On a bien CAT < MC < L-DOPA par différence de taille
Rappel : Mode contre-électroosmotique donc les plus mobiles sont détectés en dernier
Séparation 1 – 4 :
Ils sont neutres donc ne doivent pas être séparés mais on les distingue un peu. Complexation non total dans le borate donc amorce de séparation (4 puis 3 puis 2 puis 1).

II SEPARATION DE PURINES SUBSTITUEES PAR ELECTROPHORESE ET CHROMATOGRAPHIE ELECTROCINETIQUE MICELLAIRE.

   La figure 1 représente une séparation électrocinétique de purines substituées dans un tube capillaire en silice fondue de 1 m de longueur et 75 mm de diamètre intérieur. La tension appliquée est de 17,5 kV. L’ électrolyte est constitué de Na2HPO4 10 mM, Na2B4O7 6 mM et de SDS 50 mM. L’ échantillon est mis en solution dans l’ électrolyte et est introduit par électromigration à l’ extrémité du capillaire relié au pôle positif. La détection est effectuée par absorptiométrie UV à 280 nm, directement à travers le capillaire, à 90 cm de l’ extrémité par laquelle l’ échantillon est injecté.