Procédure de l’extraction de l’ADN selon le kit Qiagen

Cette procédure décrit l’extraction de l’ADN à partir du sang total prélevé sur du citrate de sodium.

Avant de commencer l’extraction mettre les réactifs, les échantillons à la température ambiante.

Préparer les réactifs suivants les instructions du kit

Identifier les tubes Falcon de 15ml conformément au nombre d’échantillons à tester ;

1. Pipeter 200µL de la QUIAGEN protéase dans chaque tube Falcon de 15mL.

2. Ajouter 2mL de sang total et mélanger brièvement, ramener le volume à 2mL en ajoutant du PBS si nécessaire,

3. Ajouter 2,4mL de diluant AL, mélanger vigoureusement en renversant les tubes 15 fois, secouer vigoureusement une dernière fois,

4. Mettre les tubes en incubation à 70ºC (dans le bain Marie),

5. Ajouter 2mL d’éthanol (96-100%) et mélanger en renversant les tubes 10 fois et agiter vigoureusement les tubes.

6. Transférer soigneusement une moitié de la solution de l’étape 5 dans la colonne QI AMP Midi placée dans un tube Falcon de 15mL et centrifuger à 3000 tours (3000 rpm) pendant 3munites.

7. Enlever les colonnes QI AMP Midi, jeter le filtrat et replacer les colonnes dans les tubes Falcon de 15mL, pipeter le reste de la solution de l’étape 5 pour ajouter à lacolonne QI AMP Midi, remettre les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger à 3000 tours (3000 rpm) pendant 3 minutes.

Essuyer tout écoulement du liquide sur les bords des tubes Falcon de 15ml et les insérer dans la centrifugeuse.

8. Enlever les colonnes QI AMP Midi, jeter le filtrat et remettre les colonnes dans des tubes Falcon de 15mL,

9. Soigneusement, ajouter 2mL du diluant AW1 dans les colonnes QI AMP Midi, (éviter de toucher la bordure) remettre les tubes dans la centrifugeuse puis centrifuger à 5000 tours (5000rpm) pendant 3minutes.

10. Sans jeter le filtrat, ajouter soigneusement 2mL du diluant AW2 dans les colonnes QI AMP Midi, et centrifuger à 5000 tours (5000 rpm) pendant 15minutes.

NB : Le temps de centrifugation doit enlever les traces du diluant des colonnes QI AMP Midi avant l’élution.

11. Placer les colonnes QI AMP Midi dans de nouveaux tubes de 15mL et jeter le filtrat.

12. Ajouter 300µL du diluant AE sur la membrane des colonnes QI AMP Midi. Incuber les tubes à la température du laboratoire pendant 5minutes, puis centrifuger à 5000 rpm (5000 tours) pendant 2minutes.

Apres cette centrifugation, l’ADN des échantillons ainsi obtenu se trouve dilué dans le diluant AE et est conservé à -20°C avant son utilisation.