Sélection de souches dégradant le 2-EHN

Au début de ce projet de thèse, la question de la biodégradabilité du 2-EHN était en suspens car aucune étude n’avait été menée pour déterminer quels pouvaient être les critères importants présidant à biodégradation de ce composé. Nous étions en lieu de craindre que la biodégradabilité du 2-EHN serait difficile pour les raisons suivantePour sélectionner des souches capables de dégrader du 2-EHN, il convenait de disposer d’un test de dégradation adapté aux particularités du substrat. Le test de Sturm a été considéré à l’origine car il est utilisé couramment pour mesurer la biodégradabilité des produits commerciaux (OCDE). Il s’agit d’un test où le composé à tester est soumis à une biomasse cellulaire constituée par une boue de station d’épuration (STEP) d’eaux urbaines. La dégradation est alors mesurée par la production totale de CO2 piégé en milieu alcalin. Comme l’a noté justement Battersby et al. (1999), le test de Sturm n’est applicable qu’aux produits organiques solubles dans l’eau et ayant une faible volatilité. Ce test ne convenait donc pas pour le 2-EHN qui est doté d’une solubilité  restreinte (12, 6 mg.L-1) et d’une tension de vapeur appréciable (27 Pa à 20°C). Un autre test, celui défini par la norme NF ISO 14593 d’octobre 2005 sur « l’évaluation en  milieu aqueux de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques par analyse du carbone inorganique dans des récipients hermétiquement clos » pouvait être également envisagé, puisque le 2-EHN est un composé volatil. Ce test dit « du CO2 dans l’espace de tête » se déroule dans une fiole fermée, avec un faible volume de liquide, contenant des microflores de boues de station d’épuration urbaine (STEP), et un espace de tête suffisamment grand pour contenir  l’oxygène nécessaire à la dégradation du substrat. Le temps du test de dégradation est de 28 jours et la dégradation du substrat résiduel est évaluée par la mesure du CO2 produit dans l’espace de têtede la fiole et du COT (carbone organique total) résiduel dans le milieu. La quantité de substrat  est de 2 à 40 mg.L-1. Pour appliquer le test du « CO2 dans l’espace de tête » au cas du 2-EHN, il eût fallu que le 2-EHN soit d’avantage soluble. Compte tenu de la pression de vapeur saturante et d’après la loi des gaz parfaits, 2 mg.L-1 de 2-EHN environ sont contenus à saturation dans la phase vapeur à 20°C et de l’ordre de 3 mg.L-1 à 30°C, température à laquelle s’effectuent les tests. A saturation, peu de 2-EHN est donc solubilisé et accessible au micro-organisme dans la phase  aqueuse (12,6 mg.L-1 à 20°C). Dans les conditions du test « CO2 dans l’espace de tête », les quantités de substrat était alors trop faibles pour conduire à des mesures précises du substrat.

Nous avons donc préféré nous inspirer du test mis au point pour la biodégradabilité des gazoles (Penet et al. 2004), celui-ci autorisant de surcroît l’examen des cas où la biodégradation du substrat est incomplète et pour lesquels s’accumulent certains métabolites. Afin de prendre en compte le caractère inhibiteur probable du substrat, le 2-EHN a été introduit dans le réacteur après dissolution dans une phase solvant inerte non métabolisable (non aqueous phase liquid ou NAPL, dans la terminologie anglo-saxonne) telle que 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane (HMN). La phase NAPL sert alors de réservoir pour le substrat hydrophobe et atténue la concentration solubilisée dans le milieu. Au fur et à mesure de sa consommation, le substrat est transféré de la phase solvant vers le milieu de culture. De la sorte, l’inhibition par excès de concentration de substrat a toutes chances d’être levée. A l’aide du test défini pour le 2-EHN, les premiers essais de biodégradation ont été effectués en utilisant des microflores de STEP urbaines, puis en utilisant des microflores de raffineries. Les tests ont été étendus à des souches pures de collection qui étaient connues pour leur capacité de dégradation des hydrocarbures. Comme nous le verrons, certains micro-organismes présentent une capacité de dégradation intéressante.