Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2

Vecteur du paludisme et son écologie

 Le Plasmodium est transmis à l’homme par les femelles de moustiques (Diptères) du genre Anopheles. L’anophèle est un insecte de la sous-classe des Pterygota et de la famille des Culicidae. Sur les 500 à 600 espèces d’anophèles décrites dans la littérature, seules 70 à 80 (10%) d’entre elles sont considérées comme des vecteurs « compétents » du paludisme humain ; leur distribution et leur efficience varient selon les régions géographiques (Boete, 2009; Pages et al., 2007). En Afrique subsaharienne, on considère qu’il existe quelque 150 espèces d’anophèles, dont une douzaine sont d’excellents vecteurs tels que : A. gambiae, A. arabiensis, A. funestus, A. nili, A. Moucheti (Carnevale and Robert, 2009). 3. Agent pathogène L’agent pathogène de cette érythrocytopathie est un eucaryote unicellulaire appartenant au règne des protistes, à l’embranchement des Apicomplexa, à la classe des Sporozoae, à l’ordre des Eucoccidiidae, à la famille des Plasmodiidae et au genre Plasmodium (Levine, 1988). Les espèces plasmodiales humaines ont été identifiées notamment : P. vivax et P. malariae par les italiens Giovanni Batista Grassi et Raimondo Filetti en 1890, puis P. falciparum par l’américain William H. Welch en 1897, P. ovale par John William Watson Stephens en 1922 et enfin P. knowlesi par Knowles et Das Gupta en 1930. 

Cycle de développement du Plasmodium 

Le cycle de développement de tous les Plasmodii humains est essentiellement le même. Il comprend une phase sexuée qui se développe chez l’anophèle femelle et une phase asexuée qui se déroule chez l’homme ; la phase asexuée comprend une phase pré ou exo érythrocytaire ou hépatique et une phase érythrocytaire responsable des manifestations cliniques du paludisme (Figure 2). 

Phase asexuée ou schizogonie chez l’homme

Cycle exo-érythrocytaire

 Les sporozoïtes inoculés, au nombre estimé entre 20 et 200 (Yamauchi et al., 2007) par l’anophèle femelle lors de son repas sanguin, restent pendant une trentaine de minutes maximum dans la peau, la lymphe et le sang. Beaucoup sont détruits par les macrophages mais certains parviennent à gagner les hépatocytes. Ils se transforment en schizontes préérythrocytaires ou « corps bleus » (formes multinucléées) qui, après 7 à 15 jours de maturation, éclatent et libèrent des milliers de mérozoïtes dans le sang (2 000 à 40 000 mérozoïtes en fonction des espèces) (Prudencio et al., 2006; Tardieux and Menard, 2008). Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2 commerciaux afin d’évaluer la croissance parasitaire. Ndiaga NGUIRANE : Mémoire de Master II en Parasitologie, FST-UCAD, 2015 6 La schizogonie hépatique a lieu une seule fois dans le cycle, la cellule hépatique ne pouvant être infectée que par des sporozoïtes. Dans les infections à P. vivax et P. ovale, certains sporozoïtes intra-hépatiques restent quiescents (hypnozoïtes) et sont responsables d’une schizogonie hépatique retardée, qui entraîne la libération dans le sang de mérozoïtes plusieurs mois après la piqûre du moustique, expliquant ainsi les reviviscences tardives observées avec ces deux espèces. Les hypnozoïtes n’existent pas dans l’infection à P. falciparum (pas de rechute) et ils n’ont pas été mis en évidence non plus dans l’infection à P. malariae, malgré l’existence de rechutes tardives (Zimmerman et al., 2004), de même que dans l’infection à P. knowlesi (OMS, Décembre 2014). 

Cycle intra-érythrocytaire

 Très rapidement les mérozoïtes pénètrent dans les globules rouges. La pénétration du mérozoïte dans l’érythrocyte et sa maturation en anneau (ring), trophozoïte puis en schizonte conduise à la destruction du globule rouge hôte et à la libération de 4 à 32 nouveaux mérozoïtes. Ces mérozoïtes pénètrent dans de nouveaux globules rouges et débutent un nouveau cycle de réplication. Cette partie du cycle correspond à la phase clinique : la parasitémie s’élève, le sujet devient fébrile, c’est l’accès palustre. En l’absence de traitement, tous les parasites évoluent progressivement au même rythme (on dit qu’ils deviennent synchrones), tous les schizontes érythrocytaires arrivent à maturation au même moment, entraînant la destruction d’un grand nombre de globules rouges de manière périodique, toutes les 24 heures (pour P. knowlesi), 48 heures (fièvre tierce de P. falciparum, P. vivax ou P. ovale) ou toutes les 72 heures (fièvre quarte de P. malariae). En pratique on observe que la fièvre tierce due à P. falciparum est rarement synchrone. L’apparition des gamétocytes à lieu en général la deuxième semaine qui suit l’infection et ces formes peuvent persister plusieurs semaines après la guérison. Les gamétocytes mâles et femelles (au dimorphisme sexuel bien marqué) sont ingérés avec le repas sanguin et pourront poursuivre leur développement que chez l’anophèle femelle (Bertin, 2013; Zimmerman et al., 2004). 

Phase sexuée ou sporogonie chez l’anophèle 

Les gamétocytes, ingérés par le moustique lors d’un repas sanguin sur un sujet infecté, se transforment en gamètes mâles et femelles qui fusionnent en un œuf libre, mobile appelé ookinète. Cet ookinète quitte la lumière du tube digestif, se fixe ensuite à la paroi externe de l’estomac et se transforme en oocyste. Les cellules parasitaires se multiplient à l’intérieur de cet oocyste, produisant des centaines de sporozoïtes qui migrent ensuite vers les glandes Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2 commerciaux afin d’évaluer la croissance parasitaire. Ndiaga NGUIRANE : Mémoire de Master II en Parasitologie, FST-UCAD, 2015 7 salivaires du moustique. Ces sporozoïtes sont les formes infectantes prêtes à être inoculées avec la salive du moustique, lors du prochain repas sanguin sur un hôte vertébré. La durée du développement sporogonique des Plasmodium se déroule en 10 à 40 jours, elle varie en fonction des conditions climatiques et des espèces en cause (Bannister and Sherman, 2009). Figure 2: Cycle de vie du Plasmodium Source: (Menard, 2005) 5. Les stades parasitaires de Plasmodium falciparum P. falciparum passe par différents stades évolutifs lors de son cycle endo-érythrocytaire. La coloration au Giemsa nous permet de distinguer ces stades évolutifs comme nous le montre la Figure 3. A partir d’une culture in vitro, nous observons dans les premières heures après la synchronisation au sorbitol, des parasites au stade anneau. Il s’agit de la vacuole d’endocytose au tour du mérozoïte prenant l’aspect d’une bague à chaton. Ce stade anneau peut être observé pendant 8 à 12 heures. Vers la 12ème heure l’anneau disparaît pour faire place à un cytoplasme bleu qui se développe progressivement avec le temps, autour d’un noyau rouge: c’est le stade trophozoïte jeune d’aspect amiboïde dans l’érythrocyte. A la 24ème heure le cytoplasme a presque rempli l’hématie et le noyau s’est divisé plusieurs fois (8 à 32) : c’est le stade schizonte. Entre la 26ème et la 33ème heure après la synchronisation on assiste à l’éclatement des schizontes libérant de nouveaux mérozoïtes envahissant de nouvelles hématies. Et vers la 36ème heure de nouveaux anneaux sont visibles sur le frottis coloré au Giemsa. Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2 commerciaux afin d’évaluer la croissance parasitaire. Figure 3: Cette phase commence avec (a) invasion d’un érythrocyte par un mérozoïte ; (b) le parasite au stade anneau se développe pour devenir un « trophozoite » en (c); au stade « schizonte », le parasite se subdivise et produit 20-30 mérozoïtes filles (d) ; puis environ 48 h après (e) libération de nouveaux mérozoïtes, et un nouveau cycle commence. 

Physiopathologie du paludisme 

Accès palustres simples 

La «crise de paludisme», appelée également «accès palustre», se manifeste par des symptômes, de frisson, de la chaleur, de la sueur rythmée par l’éclatement des globules rouges infectés par des schizontes mûrs et le déversement des exoantigènes et des toxines pyrogènes dans le sang, accompagnés le plus souvent d’anémie et de la splénomégalie. Le délai d’apparition des symptômes varie d’une semaine à quelques mois selon l’espèce plasmodiale incriminée. Les PS sont caractérisés par la succession de trois phases, de rythme particulier: phase de frisson (39°C), phase de chaleur (40°-41°C), phase de sueur (baisse assez rapide de la température) (Kaur, 2009; Roe and Pasvol, 2009; Soulama et al., 2009).

Le Neuropaludisme 

Il est dû à P. falciparum et rarement à P. vivax (Carvalho et al., 2010). Il se manifeste par: • Une fièvre à 41 °C, d’apparition brutale ou progressive, mais de montée rapide. • Des troubles de la conscience qui peuvent aller jusqu’au coma. • Parfois des convulsions. • Un rythme cardiaque accéléré (parfois supérieur à 180 battements par minute) Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2 commerciaux afin d’évaluer la croissance parasitaire. Ndiaga NGUIRANE : Mémoire de Master II en Parasitologie, FST-UCAD, 2015 9 Cet accès est très sérieux et nécessite une réanimation urgente. Le taux élevé de mortalité de cette forme de paludisme dont la physiopathogenèse n’est pas élucidée, peut être aussi lié à un délai de prise en charge, les malades arrivant souvent à l’hôpital trop tard malgré la disponibilité d’un traitement efficace (WHO, 2000). 

Résistances de Plasmodium falciparum aux antipaludiques 

Selon l’OMS, la résistance des parasites du paludisme se définit comme “L’aptitude d’une souche de parasite du paludisme à survivre ou à se reproduire malgré l’administration et l’absorption d’un médicament employé à des doses égales ou supérieures aux doses ordinairement recommandées mais comprises dans les limites de tolérance du sujet” (WHO, 1973). De nos jours, aucun continent n’est épargné par le phénomène de chimiorésistance de P. falciparum aux antipaludiques disponibles sur le marché (Das et al., 2009; Pages et al., 2007). 

Diagnostic du paludisme

Diagnostic microscopique L’examen microscopique du frottis sanguin (FS) et de la goutte épaisse (GE) est la technique de référence préconisée par l’OMS. Il permet un diagnostic rapide et un contrôle de l’efficacité du traitement antipaludique par le suivi de la parasitémie. C’est un examen peu coûteux et demeure la technique la plus utilisée. Cependant, ses performances en termes de sensibilité et de fiabilité dépendent directement de l’expérience du microscopiste et du niveau de la parasitémie du sujet infecté. Le frottis sanguin permet un meilleur examen de la morphologie des parasites et des hématies par rapport à la goutte épaisse et donc un diagnostic d’espèce plasmodiale plus aisé. Il permet en outre, de calculer la parasitémie. Le seuil de détection du FS est de 100 parasites/µL. Cependant sa sensibilité est beaucoup plus faible que la GE qui permet de détecter de faible parasitémie (10-50 parasites/µL). Le diagnostic microscopique peut également se heurter à des difficultés d’identification d’espèce particulièrement en présence de parasites altérés par un traitement présomptif ou en cas de très faibles parasitémies (Moody, 2002; Rogier et al., 2009; Siala et al., 2010). Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2 commerciaux afin d’évaluer la croissance parasitaire. Ndiaga NGUIRANE : Mémoire de Master II en Parasitologie, FST-UCAD, 2015 10

Les tests de diagnostic rapide (TDRs) 

Les TDRs reposent sur le principe de l’immuno-chromatographie en utilisant des bandelettes sensibilisées par des Acmx spécifiques détectant des antigènes plasmodiaux. Ils sont réalisés avec une goutte de sang déposée sur une bandelette et ne nécessitent aucun appareillage. • Détection des lactates déshydrogénases parasitaires (pLDH) : ce sont des enzymes glycolytiques qui présentent l’avantage d’être communes aux 4 espèces plasmodiales, détectées à tous les stades sexués et asexués du parasite. Les pLDH ont un seuil de détection identique à celui de l’ PfHRP-2, leur clairance est par contre plus rapide et ne persistent pas dans le sang après disparition du Plasmodium, d’où leur intérêt dans la surveillance des patients traités (Siala et al., 2010). • L’aldolase : des anticorps capables de reconnaître les aldolases de tous les plasmodiums humains peuvent être utilisés. La sensibilité de détection de ces antigènes est cependant encore moindre que celle des tests détectant l’PfHRP-2 et la pLDH (Rogier et al., 2009). • Détection de l’antigène Histidin Rich Protein 2 (PfHRP-2) : cette glycoprotéine spécifique de P. falciparum exposée à la surface du globule rouge parasité et en même temps activement secrétée par les formes asexuées et les jeunes gamétocytes au cours du cycle érythrocytaire avec un pic au moment de la rupture des schizontes (Rock et al., 1987). Elle peut persister dans le sang périphérique plus de 15 jours après la disparition des parasites. Ces tests sont crédités d’une sensibilité supérieure à 96% par rapport aux techniques microscopiques classiques, lorsque la parasitémie évaluée sur la GE est supérieure à 100 parasites/µL. Leur seuil de détection varie de 100 à 300 parasites/µL. La persistance de l’antigénémie après guérison et la monospécificité vis-à-vis de P. falciparum constituent les inconvénients majeurs de ces tests. Des faux positifs ont été également associés à des réactions croisées avec les facteurs rhumatoïdes. Les faux négatifs sont possibles et seraient dus à des mutations sur le gène codant pour l’PfHRP-2 ou en présence d’anticorps anti PfHRP-2 (Rogier et al., 2009; Siala et al., 2010). Les TDRs sont d’exécution rapide et de lecture facile pouvant être réalisés par un personnel rapidement formé. Ils sont particulièrement indiqués pour les structures non spécialisées où l’examen microscopique n’est pas disponible. Leurs performances dépendent essentiellement de la parasitémie. Ils sont également moins performants avec les espèces autres que P. falciparum, particulièrement P. ovale. Les TDRs doivent être considérés comme un complément des autres méthodes de diagnostic. Leurs résultats doivent être vérifiés et complétés si possible Mise en place et validation d’un test ELISA-PfHRP-2 à partir d’anticorps monoclonaux anti-PfHRP-2 commerciaux afin d’évaluer la croissance parasitaire. Ndiaga NGUIRANE : Mémoire de Master II en Parasitologie, par l’examen microscopique. Leur positivité permet une prise en charge adéquate et rapide des patients. En revanche, leur négativité ne doit pas écarter la possibilité d’un diagnostic positif (Rogier et al., 2009). 

Le QBC Malaria test ou Quantitative Buffy Coat

Le principe de cette technique microscopique de fluorescence repose sur l’utilisation d’un fluorochrome (l’acridine orange) capable de se fixer sur le noyau du parasite. La recherche du Plasmodium se fait dans 50µl de sang recueillis dans un tube à hématocrite, après concentration par centrifugation et lecture au microscope à fluorescence. Cette technique a de nombreux avantages en termes de sensibilité qui est de l’ordre de 5-10 parasites/µL, de rapidité d’exécution et de simplicité de lecture et d’analyse. Cependant, le diagnostic correct de l’espèce responsable de l’infection ainsi que la détermination de la parasitémie restent impossibles avec cette méthode. De plus, son emploi nécessite un matériel et des réactifs coûteux ce qui limite son utilisation (Lecamus and Raphenon, 1992). 8.4. Diagnostic moléculaire L’amplification génique par PCR est la technique la plus utilisée. Ces techniques moléculaires, très sensibles et spécifiques, qui peuvent détecter 1 à 5 parasites/µL de sang (soit ≤0,0001% de GRP) (De Pina et al., 2007; Tangpukdee et al., 2009), permettent l’identification des espèces plasmodiales responsables du paludisme humain (Bharti et al., 2009; Parajuli et al., 2009). La cinquième espèce, P. knowlesi est aussi détectable par ces techniques (Babady et al., 2009). En dépit de ses avantages, la biologie moléculaire ne peut remplacer en pratique courante les méthodes classiques de diagnostic du paludisme en raison du temps de réalisation relativement long, non compatible avec l’urgence du diagnostic du paludisme. La PCR est essentiellement indiquée pour la détection des faibles parasitémies en cas de forte suspicion et de difficulté de confirmation microscopique notamment chez les voyageurs sous chimioprophylaxie. Elle est également d’un apport appréciable dans l’identification des espèces plasmodiales, le suivi post-thérapeutique et l’étude des gènes impliqués dans la résistance aux antipaludiques. Ses exigences en matériel et son coût font qu’elle est encore réservée aux laboratoires spécialisés (Siala et al., 2010).