Applications à l’identification des protéines

Le protocole de préparation d’échantillon complexe pour une analyse bottom-up est long. Sa miniaturisation dans un dispositif microfluidique n’est pas simple. Outre l’ajout de l’échantillon, au moins 2 réactifs (IAM et DTT) et l’enzyme doivent être ajoutés durant le protocole, puis être éliminés. Ceci implique le développement d’une plateforme microfluidique possédant au moins 5 réservoirs, un système de vanne et un mode d’actuation contrôlable. Une puce microfluidique intégrant toutes ces structures serait complexe aussi bien au niveau de l’usinage qu’au niveau du fonctionnement, et ce notamment pour les études d’optimisation. Nous avons donc opté pour une stratégie plus directe pour évaluer notre dispositif, et de garder la puce microfluidique simple en utilisant des équipements extérieurs pour assurer les fonctions de réservoir, vanne et actuation. Tous ses équipements sont connectés à un ordinateur permettant leur automatisation. Ce chapitre comprend une description des différents composants microfluidiques utilisés et le montage réalisé pour l’utilisation de la puce. Ensuite, la présentation du protocole de traitement sur puce utilisé est suivie par l’exposition des résultats issus de la digestion de la BSA et d’échantillons complexes. Les performances du ChipFilter ont été évalués en le comparant aux méthodes conventionnelles (digestion en solution, FASP). Pour finir, Les résultats de cette comparaison vont aussi être discutés dans ce chapitre.

Installation microfluidique

pour le mode d’actuation, nous avons opté pour une pompe externe pour 2 raisons majeures. La première est que la présence de la membrane de filtration moléculaire entraine une résistance hydrodynamique trop importante pour être compatible avec les modes d’actuation par capillarité et par électro-osmose. La seconde raison est liée au besoin de contrôler la pression et le débit durant le protocole de préparation d’échantillon. Le contrôle de la pression permet d’assurer l’intégrité de la puce et de son fonctionnement. Par ailleurs, contrôler le débit permet de calculer la quantité d’échantillon ou de réactif ajoutée et de déterminer le temps d’exposition des protéines à un réactif donné (temps de réaction). Durant cette étude, nous avons utilisé une pompe MFCS et un contrôleur de débit Flow-EZ de Fluigent. Dans l’installation microfluidique définitive, c’est une pompe Flow-EZ associé à un contrôleur de débit Flow- Unit-S qui ont été utilisés. La gamme de pression de la pompe est de 0 à 1000 mbar tandis que le contrôleur de débit fonctionne entre 0 et 7 µL/minute. Réservoir P-Cap : Les P-Caps sont des accessoires permettant d’utiliser les tubes standards (1,5; 2; 10; ou 50 mL) comme des réservoirs d’échantillon ou de réactifs connectés à un dispositif microfluidique. Ils permettent la pressurisation de ces tubes sans être en contact avec leur contenu.

Vanne M-switch : Le M-switch est une vanne possédant une vanne multidirectionnelle, avec 10 entrées et une sortie. Cette configuration permet d’opérer des injections séquentielles depuis 10 réservoirs différents. Ceci permet de réaliser des injections depuis les tubes d’échantillon, de réactifs, d’enzyme et de solution de rinçage pour automatiser le protocole bottom-up complètement. de la pression. Un split connecté à la pompe permet de pressuriser 4 tubes en même temps. Tous les tubes sont connectés à la vanne M-switch. La sortie de ce dernier est reliée au contrôleur de débit Flow-Unit-S. Le ChipFilter est connecté à la sortie du contrôleur de débit. La pompe, la vanne et le contrôleur de débit sont connectés à un ordinateur qui grâce au logiciel Microfluidic Automation Tool (MAT) permet d’automatiser complètement leur fonctionnement. Pour les protocoles de digestion, nous avons opté pour le mode Direct flow control. Ce mode de fonctionnement consiste à appliquer un débit donné et de laisser la pompe se mettre à la pression la plus appropriée pour se placer à ce débit. 29). L’idée était de laisser une très faible pression pour éviter tout reflux pendant les temps d’incubation. Le protocole retenu est détaillé dans le Tableau 7. standard est chargé dans la puce à un débit de 2 µL/minute. Pour la réduction et l’alkylation, les réactifs correspondants sont chargés séquentiellement grâce à la vanne de sélection à 10 voies. Ensuite, un rinçage est effectué avec de l’ammonium bicarbonate (ABC) 50 mM, pH 8 pour préparer la digestion. Puis une solution de trypsine de 0.1 µg/µL est chargée à 2µL/min puis le débit est abaissé à 0.4 µL/minute d’une solution d’ABC 50 mM avant de laisser la digestion se faire à faible débit : 0.4 µL/minute avec une solution d’ABC 50 mM. Finalement, l’élution est réalisée en appliquant un débit de 2µL/min.